产品描述

Cyanine 3（Cy3），是花青素荧光素染料家族的成员之一，是化学合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以两种异构体的形式供货，一种是非磺化花青素（non-sulfonated cyanines），一种是磺化花青素（sulfonated cyanine）。两者的光谱性质几乎一致，因此大部分应用可相互替换，比如，都可用于标记DNA或蛋白等生物分子。两者的主要区别在于：磺化染料是水溶性的，在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂，并且降低染料在水中聚集的可能性，增强标记效率。

本Cyanine 3（Cy3）是以磺化染料的形式供货，易溶于水，Ex=555 nm，Em=565 nm，具有明亮荧光，光稳定性强，pH非敏感性等优点，适用于标记多肽、蛋白以及核酸等生物分子，以通过后续荧光成像以及其他荧光生物学方法分析目的蛋白。

本Cy3 NHS ester，即含N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide）活化基团的Cy3，可直接与生化分子上的氨基（-NH2）反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺。

产品性质

英文别名（English Synonym）	Cyanine 3, monosuccinimidyl ester
分子量（Molecular Weight）	829.03
外观（Appearance）	紫色固体
Ex/Em	555nm/565nm
溶解性（Solubility）	溶于DMSO，DMF，水
结构式（Structure）

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃干燥避光保存，有效期1年。

注意事项

1）NHS ester基团对湿度非常敏感，务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。

2）NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽（浓度：1-1mg/ml）伯胺的连接反应建议在pH 7-9范围内进行。使用不含氨基的缓冲体系，pH 7-9。比如100 mM 磷酸钠，150 mM 氯化钠， pH 7.5； 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸钠/碳酸氢钠, pH 8-9；或100mM 硼酸缓冲液, pH 8-9。

3）不要使用含伯胺的任何缓冲液，比如Tris，甘氨酸。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5) 本产品仅作科研用途!

 

使用方法（用Cy3-NHS Ester 标记抗体）

注意：可参考本方法进行多肽，蛋白或者其他分子的标记，需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系，样本浓度，染料浓度等参数做出合适的调整。

1）用不含氨基的合适的缓冲液（eg.100mM磷酸钠，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗体使其浓度达到1-5mg/mL。【注】：如抗体中有残留Tris或 glycine 污染，则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。

2）使用前，用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍，例如，待标记的IgG浓度为1mg/mL（eg 6.7µM），则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM；如待标记的IgG浓度为2.5mg/mL，则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM；

3）向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂，以达到预期的标记效率。【注】：当用Cy 3 NHS ester标记抗体或其他蛋白，亮度最高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12，取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景，丧失抗体特异性结合，导致聚集。建议根据应用优化标记比率。

4）室温孵育60min（或更长）；

5）利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂；

6）分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值；

7）测定Cy3标记效率（DOL）和标记浓度。见下公式。

公式一. 利用下面公式计算Cy3标记效率（DOL）及其浓度（mg/ml）

Eq.1    Number of Cy3 dye per protein=molarity Cy3 dye / molarity protein

Eq.2    [Molarity of Cy3 dye]=A555/ε555

Eq.3    [Molarity of protein]=A280C/ε280

Eq.4    mg/ml=[A280-(A555×0.08)/(E1%/10)]×dilution   factor

【注】上述参数如下： A555=conjugate absorbance at   555±2nm ε555=molarextinction coefficient   Cys dye =150000M-1cm-1 A280= conjugate absorbance at   280nm A280C =corrected conjugate   absorbance at 280nm= A280-( A555×0.08) ε280= molarextinction coefficient   protein(M-1cm-1)=MWp×E1%/10

应用举例

用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记 0.1 mL山羊IgG（浓度为1mg/mL）。标记后脱盐去除未标记染料，在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:

A280=0.2906 

A555=0.9825

另：山羊IgG分子量为150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1

计算DOL如下：

By Equation 2      Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM

By Equation 3      Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM

By Equation 1      number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3

则计算Cy3-IgG protein 浓度为（mg/mL）：

By Equation 4     mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL

 

HB180710