10 × Hifair^® V Buffer可与Hifair^® V Reverse Transcriptase (Cat#14603)配套使用，为逆转录反应创造最佳条件。

 

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		15661ES03	15661ES08	15661ES50
15661-A	10 × Hifair® V Buffer	1 mL	5 mL	50 mL

 

产品应用

一步法RT-qPCR；基因克隆；荧光定量。

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期3年。

 

使用方法

本品在逆转录反应体系中终浓度为1 × Hifair^® V Buffer即可。

 

注意事项

1. 请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；

2. 所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；

3. 为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

逆转录实验案例

第一链cDNA合成操作步骤

1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量）

组分	使用量
RNase free ddH2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM)	1 μL
or Random Primers (50 μM)	or 1 μL
or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1-500 ng

65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后，加入下表中的逆转录反应液，并轻轻吹打混匀。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	13 μL
10 × Hifair® V Buffer	2 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (1000 U/μL) (Cat#14603)	0.2 μL
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL
RNase free ddH2O	to 20 μL

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
42℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略。

2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂二级结构的模板，可将逆转录温度提高至50-55℃。

3）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。

※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

※ 该逆转录酶也适用于一步法RT-qPCR，推荐每25 μL反应体系，添加10-20 U逆转录酶，也可根据实际情况逐步增加逆转录酶用量。

 

HB220614