肠道是人体重要的消化器官,肠指的是从胃幽门至肛门的消化管, 是消化器官中最长管道，人体肠道结构主要包括小肠和大肠。肠道疾病非常常见，如肠梗阻、慢性炎症性肠病、结直肠癌等等，其中结直肠癌已成为威胁人类健康最严重的疾病之一。因此，肠道的研究是现在非常热门的领域，有着广阔的应用前景。
2009年，Hans Clevers研究团队利用来源于肠隐窝的单个干细胞（Lgr5+）或单个隐窝结构，首次在体外成功培养出3D肠道“类器官”。离体的肠道干细胞或隐窝在基质胶、小分子化合物、细胞添加剂以及多种生长因子中培养可不断增殖，具有自我更新及分化能力，能够分化形成多种肠道成熟细胞，在肠道疾病模型建立和研究中发挥重要的作用。[1]
图1. 单细胞在单孔中的集落形成效率[1]
1. 隐窝分离，细胞分离和细胞培养
通常在含有2 mM EDTA的PBS中，4℃下孵育30 min，从小鼠小肠中释放隐窝。对分离的隐窝进行计数并成球。在24孔板中，加入基质胶、生长因子（10-50 ng/mL EGF、500 ng/mL R-spondin 1、100 ng/mL Noggin）孵育。
2. 分选实验
分离的隐窝37℃孵育45 min，分离后的细胞通过孔径为20 μm的细胞过滤器。将分选的细胞收集在隐窝培养基中，并加入含有Jagged-1多肽（1 μM）的基质胶中，每孔1个细胞（在96孔板中，含5 mL基质胶）。
3. 隐窝培养基
48孔板加入250 μL培养基，96孔板100 μL培养基，并且添加小分子化合物Y-27632（10 μM），每隔一天添加一次生长因子，每4天更换一次培养基。
4. 传代
将类器官从基质胶中取出，机械分离成单隐窝结构域，然后转移到新鲜的基质胶中。每1-2周进行一次，分割比例为1：5。[1]
图2. 肠隐窝培养系统的建立[1]
图3. b、c、d分别为培养第5天、14天、3周后的情况，e为隐窝样器官的示意图[1]
在培养小鼠结肠类器官时，培养基中需要添加p38 MAPK激酶抑制剂（SB-202190）、TGF-β抑制剂（A 83-01）、Rho激酶抑制剂（Y-27632）和GSK抑制剂（CHIR-99021）、Jagged-1等小分子化合物，以及EGF、R-spondin-1、Noggin和Wnt-3A等生长因子。[1] [2]
研究团队根据肠上皮细胞的生长需求来设计的这样一个培养系统，Wnt信号传递是隐窝增殖的关键要求，而Wnt激动剂R-spondin1在体内诱导隐窝明显增生，表皮生长因子（EGF）的信号转导与肠道增殖有关，Noggin的转基因表达诱导了隐窝数量的增加。Rho激酶抑制剂Y-27632抑制胚胎干细胞失巢凋亡，降低细胞死亡率。细胞间的Notch信号对于维持隐窝的增殖至关重要，我们还提供了一种Notch激动性肽（Jagged-1）。[1] [2]
2022年Hans Clevers团队创新性地引入了IL-22来优化hSIOs培养基组成，极大地提高了肠道类器官的出芽比例，上调潘氏细胞的表达水平，更好地模拟人体内肠道的组成性表达成分。如下图。
图4.人结肠培养（小分子化合物Nicotinamide、SB 202190和A 83-01对培养的影响）[2]
图5.人结肠腺癌细胞的培养过程[2]
类器官培养和药物刺激的hSIO培养基中需要添加的小分子化合物、添加剂和细胞因子，分别为：B-27（1%），N-乙酰半胱氨酸（1 mM），烟酰胺（10 mM），Alk 4/5/7抑制剂A 83-01（500 nM）, p38抑制剂SB 202190（3-10 μM），前列腺素E2（10 nM），CHIR-99021（3-10 μM），Rho激酶抑制剂Y-27632二盐酸盐（10 μM）和Primocin（100 μg/mL），BP-1-102，LY294002，MK-2206，雷帕霉素，N-2，谷氨酰胺，HEPES，青霉素/链霉素，R-Spondin，Noggin（2%）,人EGF（50 ng/mL），人IL-22（2 ng/mL），具体如下图所示（图六）。[3]
|
化合物名称 |
货号 |
|
53002ES |
|
|
53005ES |
|
|
53003ES |
|
|
52604ES |
|
|
53007ES |
|
|
50303ES |
|
|
51402ES |
|
|
53174ES |
|
|
52403ES |
|
|
53008ES |
|
|
52404ES |
|
|
60810ES |
|
|
60162ES |
|
|
60117ES |
|
|
60701ES |
|
|
Primocin |
60281ES |
|
60703-60705ES |
|
|
60706ES |
|
|
90121ES |
|
|
90155ES |
|
|
92276ES |
|
|
92528ES |
|
|
92701ES |
|
|
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
40191ES08/10 |
1.重悬隐窝基质胶混合物，孔板中加入一定量的混合物和隐窝培养基（如24孔板可加入50 μL混合物和500 μL培养基）；
2.用离心管转移到超净工作台里，PBS（含双抗）润洗2-3次，将肠粘膜转移至含有EDTA（2 mM）的溶液中，置于4℃，小肠消化约30 min，结肠消化约1 h；
3.将消化好的小肠粘膜转移至离心管中，加入PBS，摇晃均匀后用70 μm的细胞过滤筛过滤，1000 r/min室温离心5 min，结肠隐窝无需过滤；
4.弃上清，加入培养基重悬沉淀，计数，隐窝的数量约10个/μL为佳；
5.加入一定量的悬液到离心管中，室温离心5 min；
6.加入预冷的基质胶混合物（基质胶：培养基为2:1）重悬沉淀；
7.将重悬液按一定量接种在预热的孔板中；
8.每个孔加入一定量的预热的隐窝培养基，37℃培养1-2周。
9.在培养板中，每孔加入一定量的培养基，用枪头将基质胶小心的刮出，取悬液，转移到离心管中；
10.将要传代的隐窝置于冰上5-10 min；
11.用枪头吹打基质胶，反复进行，直至基质胶被打碎，中间尽量避免气泡产生；
12.将消化好的小肠粘膜转移至离心管中，加入PBS，摇晃均匀后用70 μm的细胞过滤筛过滤，1000 r/min室温离心5 min，结肠隐窝无需过滤；
13.弃上清，加入培养基重悬沉淀，计数，隐窝的数量约10个/μL为佳；
14.加入一定量的悬液到离心管中，室温离心5 min；
15.加入预冷的基质胶混合物（基质胶：培养基为2:1）重悬沉淀；
16.可按1：1 - 3：1进行传代培养；
17.将需要冻存的类器官置于冰上5-10 min；
18.收集类器官，离心后弃上清；
19.加入冻存培养液重悬类器官，分装至冻存管中，置于-80℃，24 h后置于液氮中长期保存。
利用肠类器官构建的体外肠道模型，可以极大的推动对肠道疾病发生发展的研究，为高通量药物筛选、新物研发、药物功能检测、靶向治疗、个性化精准医疗、再生医学提供新的重要的研究平台和途径。肠道类器官的出现，为肠道疾病的研究和治疗打开了一扇全新的大门。
[1] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5. doi: 10.1038/nature07935. Epub 2009 Mar 29. PMID: 19329995.
[2] Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Sep 2. PMID: 21889923.
[3] He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022 Sep 1;29(9):1333-1345.e6. doi: 10.1016/j.stem.2022.08.002. Epub 2022 Aug 23. Erratum in: Cell Stem Cell. 2022 Dec 1;29(12):1718-1720. PMID: 36002022; PMCID: PMC9438971.
