干货│重组酶聚合酶扩增RPA技术—

干货│重组酶聚合酶扩增RPA技术——核酸扩增新选择

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种新型核酸恒温扩增技术，可以在37~42 ℃条件下，10~30 min内实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、动物疫病、食品安全、生物安全、农业等领域。

RPA等温扩增技术优势

1. 检测灵敏度高：可将痕量的核酸模板（低至单拷贝）扩增至可以检出的水平，且通常无需进行核酸纯化。

2. 无需昂贵的配套仪器设备：37~42°C恒温反应，无须热循环，摆脱仪器束缚，方便快捷。

3. 样本耐受性高：适合复杂样本的扩增检测。例如未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需要通过热或碱进行预处理促进核酸释放即可。

4. 检测方法多样化：包括电泳法检测、荧光探针法检测、侧流层析试纸条检测等。

RPA等温扩增技术原理

RPA等温扩增技术依赖多种酶与蛋白的参与。RPA的反应过程中，首先重组酶蛋白与引物形成复合物（A），并在双链DNA中寻找同源序列（B）。然后通过重组酶的链置换活性将引物插入同源位点（C），并且单链结合蛋白稳定置换DNA链（D）。随后重组酶被分解，使得引物的3'末端被链置换并与聚合酶结合（E），使其延长引物（F），通过循环重复该过程对模板上的目标区域进行指数式扩增。

图1.RPA等温扩增技术原理图[1]

RPA等温扩增技术检测方法

1. 电泳法：在RPA的基础上，用凝胶电泳的技术进行终产物检测。

2. EXO探针法：在RPA的基础上，加入了核酸外切酶III（exonuclease III，即exo）和exo荧光探针，核酸外切酶III会特异地切割荧光探针（THF位点），然后荧光集团与淬灭集团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。

图2.EXO探针法检测原理图[2]

3. Fpg探针法：在RPA的基础上，加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（fgp）及fpg荧光探针，当探针与模板结合时，fpg酶识别dR连接臂（dR group）并切割该位点，使得荧光基团与淬灭集团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。

图3.EXO探针法检测原理图[2]

4. 侧流层析试纸条（LF-RPA）：在RPA的基础上，加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即nfo）、nfo探针和生物素标记的反向引物。当nfo探针与模板链互补时，nfo酶识别并切割THF位点，扩增获得既有探针标记物又有引物标记物的扩增子。通过侧流层析法如抗体或抗体/链霉抗生物素蛋白夹心法鉴定结果。

图4.EXO探针法检测原理图[1]

5. 絮凝分析检测：RPA扩增子在低pH缓冲条件下与磁珠一起孵育，磁珠表面上沉淀的RPA扩增子交联其他扩增子-磁珠形成共轭体，从而絮凝出溶液。同时絮凝现象的产生只能由长度超过100个核苷酸的扩增子触发。没有靶标的模板进行RPA反应不会产生长的“DNA聚合物区段”因而不会发生絮凝，絮凝分析是常用的终点检测方法，肉眼可视化效果好，可用于RPA扩增子的快速定性检测。

图5.RPA絮凝分析检测原理图[3]

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参考文献

[1] 施奕,徐昌平,余蓓蓓,卢亦愚,梅玲玲.重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J].病毒学报, 2020,36(03):522-532.

[2] Li J, Macdonald J, von Stetten F. Review: a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification. Analyst. 2018 Dec 17;144(1):31-67. doi: 10.1039/c8an01621f. Erratum in: Analyst. 2020 Mar 2;145(5):1950-1960. PMID: 30426974.

[3] Wee EJ, Lau HY, Botella JR, Trau M. Re-purposing bridging flocculation for on-site, rapid, qualitative DNA detection in resource-poor settings. Chem Commun (Camb). 2015 Apr 7;51(27):5828-31. doi: 10.1039/c4cc10068a. Epub 2015 Jan 26. PMID: 25622026.

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