血液微生物研究

长期以来，健康人群的血液被认为是一个无菌环境，传统教科书将血液描述为“免疫监控下的无菌液体”。这一信念建立在经典的细菌培养技术基础之上——大多数情况下，健康个体的血液培养确实为阴性。

然而，随着分子生物学技术，特别是高通量测序技术的应用，这一认知正在被修正。越来越多的研究揭示，在健康个体的血液中同样存在着低丰度的微生物DNA，包括来自病毒、细菌和真菌的遗传物质。这些微生物来源多样，主要通过肠道屏障和口腔两个途径进入血液循环系统。他们不是“单纯的路过者”，而是在不同的病理条件下会发生显著的组成变化，发挥着潜在的生理和病理作用。

图1："血液无菌"到"血液微生物组"的认知演变历程（图片来源：网，侵删）

多项临床研究证实，宏基因组测序在血流感染病原检测中的阳性率显著高于传统血培养。

一项纳入78例脓毒症患者的研究对比了血源mNGS和常规培养方法的检测效能。结果显示，无论患者是否接受过抗生素治疗，mNGS的阳性率均显著高于培养，前者为80.77%，后者为37.18%。在这78例患者中，有38例的病原体仅通过mNGS检出，这些患者在医生根据mNGS结果调整治疗方案后，有23例获得了良好的临床效果。

在严重感染患者中，mNGS的病原学诊断率（78.89%）同样显著高于传统微生物学检测（20%），尤其在肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群和嗜肺军团菌等罕见病原体的检出中展现出独特优势，这些病原体使用常规方法完全无法检出。

从血液样本到最终检测报告，宏基因组测序的完整流程包括四个关键环节。

样本采集与血浆分离：采血时推荐使用专用的游离DNA保存管，可在常温下稳定保存，方便样本运输和集中处理。血浆分离需采用二次离心法。值得注意的是，全血和血浆的选择会影响检测结果。研究表明，全血样本的细菌reads数高于血浆样本，但血浆样本的方法重现性更好。

宿主去除：这是血液mNGS中最关键的一步。针对白细胞的过滤装置可在不同血液体积下实现一定程度的白细胞去除，不改变微生物组成，能够保留微生物reads。

核酸提取：血液样本中的病原核酸提取面临多重挑战。裂解方案需要高效裂解病毒、支原体、细菌、真菌等各类病原微生物，释放核酸的同时最大限度地减少抑制物释放。采用磁珠法自动化纯化，摒弃传统酚氯仿抽提，全程无有机溶剂接触。

文库构建与测序：提取的核酸经末端修复、接头连接等步骤构建测序文库，随后加载到测序仪上进行高通量测序。测序数据经质控、去除人源序列、与病原体数据库比对、背景噪声过滤后，最终识别出具有临床意义的病原体。

血流感染特别是脓毒症，是全球范围内死亡率最高的感染性疾病之一。血液微生物研究在血流感染领域最为成熟的应用场景，正是通过检测血液中微生物DNA实现对感染的精准诊断。除常规细菌和真菌外，宏基因组测序在病毒等病原体的检测方面也展现出显著优势。在儿童疑似血流感染的队列中，扭矩坦诺病毒、人β疱疹病毒5型和EB病毒是多种病毒中最常被识别的病原体。混合感染也是血液微生物研究的重要切入点。在重症监护病房中，混合菌血流感染的识别对于精准治疗至关重要，不同病原谱的患者其临床特征和治疗方案存在显著差异。

图2：血流感染的病理机制（图片来源：网，侵删）

随着研究的深入，血液微生物组的应用边界正在从传统的感染性疾病向外延伸。在心血管疾病、代谢紊乱、神经系统疾病和肝脏疾病等多种非感染性疾病中，血液微生物组均表现出显著的特异性改变。

肿瘤液体活检：在肺癌患者中，血浆循环微生物DNA展现出了优异的诊断潜能，构建的基于5个物种的分类器在验证队列中的AUC值超过0.91，这意味着基于血液微生物谱的肺癌无创筛查具有广阔前景。

不同肿瘤的鉴别诊断：一项关于肝细胞癌与转移性结直肠癌的研究进一步拓展了血液微生物cfDNA的应用边界。研究通过对cfDNA进行鸟枪法宏基因组测序，成功识别出了能够鉴别这两种肿瘤的独特细菌特征，为鉴别原发性与继发性肝脏肿瘤提供了新的无创工具。