产品描述

线粒体膜电位荧光探针JC-10是JC-1的升级产品，同样可用于检测线粒体膜电位的变化。因JC-1虽然在许多实验中被广泛应用，但是其水溶性很差，即使在1 μM浓度的条件下，JC-1也会在水的缓冲液中析出。而JC-10具有更好的水溶性，可以在某些需要高浓度染料的实验中替代JC-1。虽然在一些细胞系中JC-10有着比JC-1更好的表现，不过，JC-10的性能表现极具细胞依赖性特征。

正常细胞内，JC-10选择性聚集在线粒体基质中形成可逆的红色荧光聚合物（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-10由多聚体转变为单体形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。这两种颜色的变化可以用流式细胞仪上的标准滤光器检测到，绿色荧光可用FL1通道分析，红色荧光可用FL2通道分析。除了用于流式细胞术，也可以用于荧光成像和荧光酶标板检测平台。

本试剂盒中提供了阳性对照CCCP，其能诱导线粒体膜电位下降。对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品。

产品组分

编号	组分	规格
40752-A	JC-10（200×）	100 μL×5
40752-B	CCCP（10 mM）	20 μL
40752-C	JC-10染色缓冲液（5×）	80 mL
40752-D	超纯水	90 mL

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20℃干燥避光保存，分装，以避免反复冻融，一年有效。超纯水和JC-10染色缓冲液（5×）也可4℃保存。

注意事项

1）JC-10（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2）须把JC-10（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后才可加入JC-10染色缓冲液（5×）。不可先配制JC-10染色缓冲液（1×）再加入JC-10（200×），否则JC-10将很难充分溶解并会严重影响后续的检测使用。

3）使JC-10染色缓冲液（1×）保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。

4）JC-10探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测过程。在检测前需冰浴保存。

5）请勿把JC-10染色缓冲液（5×）全部配制成JC-10染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-10染色缓冲液（5×）。

6）如果发现JC-10染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。

7）CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

8）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

9）本产品仅作科研用途！

使用方法

1. JC-10染色工作液的配置

取适量JC-10（200×），按照每50 μL JC-10（200×）加入8 mL超纯水的比例稀释，剧烈震荡充分溶解并混匀JC-10，然后再加入2 mL JC-10染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-10染色工作液。

2. 阳性对照的设置

取出试剂盒中供的CCCP（10 mM）按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中，使其终浓度为10 μM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载JC-10，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10 μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-10染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-10染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3. 细胞染色

3.1对于悬浮细胞

1）取1×105～6×105个细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中（可以含血清和酚红），加入0.5 mL JC-10染色工作液，颠倒混匀。
2）37℃孵育20分钟。孵育期间，按每1 mL JC-10染色缓冲液（5×）加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液（1×），并置于冰浴，作为洗液。
3）37℃孵育结束后，600g  4℃离心3～4分钟，弃上清，注意尽量不要吸除细胞。加入1 mL JC-10染色缓冲液（1×）重悬细胞，600 g， 4℃离心3～4分钟，弃上清，重复一次。
4）用适量JC-10染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

3.2对于贴壁细胞

1）对于6孔板，吸除培养液，根据具体实验如有必要可用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1 mL细胞培养液（可

以含血清和酚红）。
2）然后加入1 mL JC-10染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。孵育期间，按每1 mL JC-10染色缓冲液（5×）加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液（1×），并放置于冰浴，作为洗液。

3）37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-10染色缓冲液（1×）洗涤2次。

4）加入2 mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
注：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

3.3对于纯化的线粒体
1）把配制好的JC-10染色工作液用JC-10染色缓冲液（1×）稀释5倍。取5倍稀释的JC-10染色工作液0.9 mL 加入0.1 mL总蛋白量为10～100 μg纯化的线粒体。
2）用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。

4. 荧光观测

检测JC-10单体时可以把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-10聚合物时，可以把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。

注：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-10单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-10聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。