Q：初始DNA 投入量范围是多少？
A：12201 适用于 500 pg-500 ng Fragment DNA 样本
Q：建库试剂盒里面包含接头吗？
A：建库试剂盒一般都是不包含接头，接头有设置单独的货号，可根据平台和样本数量等选择。
Q：12199ES 和 12201ES的区别是什么？怎么选？
A：扩增模块不同，如果需要高产量扩增，推荐 12199ES建库试剂盒；如后续对保真度要求较高，比如做 SNP 检测相关，则选择12201ES建库试剂盒。
Q：12199 12200 建库一次需要多少磁珠？
A：磁珠用量可参考下表：
| 建库类型 | 需使用磁珠的步骤 | 单个样本需磁珠量 | 96T样本需磁珠量 | 60mL磁珠需配套试剂盒数量 |
| DNA | 常规流程 | 纯化(0.6×)，纯化(0.9×) | 105μL | 10.08mL | 6.0个96T建库试剂盒 |
| 纯化(0.6×)，纯化(0.9×)，分选(0.8/0.2×) | 205μL | 19.68mL | 3.0个96T建库试剂盒 |
| 减半（扩增模块减半） | 纯化(0.6×)，纯化(0.9×) | 75μL | 7.2mL | 8.3个96T建库试剂盒 |
| 纯化(0.6×)，纯化(0.9×)，分选(0.8/0.2×) | 175μL | 16.8mL | 3.6个96T建库试剂盒 |
| 全部体系减半 | 纯化(0.6×)，纯化(0.9×) | 52.5μL | 5.04mL | 11.9个96T建库试剂盒 |
| 纯化(0.6×)，纯化(0.9×)，分选(0.8/0.2×) | 152.5μL | 14.64mL | 4.1个96T建库试剂盒 |
产品操作：
Q：为什么末端修复/加 A 步骤需要开热盖而接头连接不开？
A：末端修复的时候有一步是 72℃，打开热盖防止反应液的冷凝情况，保证反应液体不损失。而接头连接温度较低，影响不大所以关掉热盖。
Q：针对FFPE 样本建库，有没有特殊的建议？
A：针对低质量 FFPE 样本也能取得较好的文库质量，如客户追求更高的文库产量，客户可以选购石蜡样本修复试剂（Cat#12606）。该试剂可以在末端修复时同步进行样本修复，无需额外的实验步骤。
Q：12199ES和 12201ES 建库中都需要哪些酶？
A：1）末端修复/加 A： T4 DNA 聚合酶耐高温 Taq 酶；2）T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）；3）接头连接
T4 DNA 连接酶；4）12201ES 对应的扩增模块式 12621/12624 高保真 DNA 聚合酶；12199 对应的扩增模块是 12620 高扩增效率的。
Q：接头连接之后可以直接进行分选吗？
A：不可以，Ligation Enhancer 内含高浓度的PEG，会对分选造成显著影响，所以接头连接后如果进行
片段分选必须先纯化。
Q：FFPE 样本修复试剂对建库具体的影响是什么？
A：FFPE 样本修复试剂针对石蜡样本的切口，缺刻以及末端氧化的情况可有效进行修复。对文库来说最直观的影响在于产量的提升，而对于测序质量如 Coverage 等无明显作用。而且修复试剂的修复作用，有额外引入突变的可能，肿瘤等客户不建议使用。
结果分析
Q：文库片段大小分布一般是什么样的？
A：因为二代测序技术的读长有限，根据不同的测序需求，仪器型号，以及测序模式（单端还是双端测序），一般在 200-800bp 范围内。
Q：不同测序深度Coverage 解读？
A：Coverage 即基因组覆盖度，指的是测序获得的序列占整个基因组的比例。不同测序深度下序列的coverage 肯定也是有差异的。简单来说，10×意思就是说有 10 个测序 reads map 到基因组的某个位置，200×是说有 200 个测序 reads map 到基因组的这个位置。一般情况下测序深度越高，coverage 也会随之降低。
Q：构建得到的文库产量低
A： （1） DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）
Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及 A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。
（2）RNA 污染：样本中存在RNA 污染会导致DNA 定量不准确，使文库构建时DNA 上样量不足。
（3）PCR free 的时候上样量不足：当使用完整接头且Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对DNA 文库进行PCR 扩增。
（4）接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。判断接头是否降解的方法：
a. 用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。
b. 用Qubit 酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。检测方法：取 1uL，15uM 的complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。
Q：文库电泳的时候条带异常
A：主要有以下原因造成文库大小异常：
1. 出现小片段（60-120bp）:小片段一般为接头片段或接头所形成的二聚体，一般可用 12601 DNA 磁珠进行纯化；
2. 文库富集之后出现大片段：一般文库接头在 120 bp 左右，若文库片段增加幅度超过了 120bp 则可能是扩增过度，导致片段扩增异常。此时需减少PCR 循环数；
3. 接头连接前片段异常，片段化时间或者条件选择不当。
