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产品描述
Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。
试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo (dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
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组分编号和名称 |
12301ES08 |
12301ES24 |
12301ES96 |
12301ES98 |
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BOX-I |
12603-A |
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mRNA Capture Beads |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
50 mL |
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12603-B |
|
Beads Binding Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
50 mL |
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12603-C |
|
Beads Wash Buffer |
5 mL |
15 mL |
60 mL |
3×250 mL |
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12603-D |
|
Tris Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
50 mL |
|
|
BOX-II |
12301-A |
|
Frag/Prime Buffer |
150 μL |
450 μL |
2×900 μL |
18.5 mL |
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12301-B |
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1st Strand Enzyme Mix |
16 μL |
48 μL |
192 μL |
2×1mL |
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12301-C |
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Strand Specificity Reagent |
50 μL |
150 μL |
580 μL |
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12301-D |
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2nd Strand Buffer (dNTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
30 mL |
|
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12301-E |
|
2nd Strand Buffer (dUTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
30 mL |
|
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12301-F |
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2nd Strand Enzyme Master Mix |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
5×1 mL |
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12301-G |
|
Ligation Enhancer |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
30 mL |
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12301-H |
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Novel T4 DNA Ligase |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
5×1 mL |
|
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12301-I |
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
200 μL |
600 μL |
2×1200 μL |
25 mL |
||
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12301-J |
|
Primer Mix |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
5 mL |
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运输与保存方法
冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！
Box I：2-8 °C保存；Box II：-20 °C保存。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度
6. 针对大规格1000T，客户在使用前需提前复融，保证充分解冻且混匀。
二、应用范围
1 本产品仅作科研用途！
2. 本试剂盒适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。
3. 本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。
4. 本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：
基因表达(gene expression)
单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery)
基因融合鉴定(gene fusion identification)
剪切变异体分析(splice variant analysis)
三、关于接头连接(Adapter Ligation)
1.本公司可提供长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615-Cat#12618)；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12414-12415)。
2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3.使用接头时，请提前将接头取出放在4 °C或冰盒上解冻；室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4 °C保存48 h。
表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表
|
Input Total RNA |
Adapter stock concentration |
|
10 ng |
1 μM |
|
100 ng |
1.5 μM |
|
500 ng |
3 μM |
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≥1 μg |
5 μM |
四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4 °C可保存2天，-20 °C可保存1个月。
五、关于文库扩增 (Library Amplification)
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2. 如果您使用Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用index primers进行扩增，加上相应的barcodes。
3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
|
Input Total RNA |
Number of cycles |
|
|
Non-stranded |
Stranded |
|
|
10 ng |
15 |
15 |
|
100 ng |
14 |
14 |
|
500 ng |
12 |
13 |
|
1 μg |
11 |
12 |
【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
六、自备材料 (Other Materials)
1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。
2. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
3. Adapters：含Index的长接头 (Yeasen Cat#12615-12618)或者无Index的短接头试剂盒 (Yeasen Cat#12414-12415)。
4. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
5. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
使用方法
一、自备材料
1.纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Cat#12601)或AMPure XP Beads (Cat#A63880)或其他等效产品。
2.RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
3.Adapters：barcoded adapter（长接头）或者无barcode的短接头试剂盒。
4.文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
5.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
图1 mRNA建库试剂盒操作流程
三、操作步骤
3.1 mRNA纯化和片段化 (mRNA Purification and Fragmentation)
1. 将mRNA Capture Beads从2-8 °C取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。
2. 准备一个Nuclease free离心管，取10 ng-4 μg总RNA，用Nuclease Free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。
3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。
4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65 °C，5 min；25 °C，5 min；25 °C，hold，完成RNA与捕获磁珠的结合。
5. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。
6. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
7. 重复步骤6，共洗涤两次。
8. 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
9. 将样品置于PCR仪中，80 °C，2 min；25 °C，hold，将mRNA洗脱下来。
10. 将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
11. 室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。
12. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
13. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回
至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。
将样品从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94 °C），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94 °C，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。
表3 mRNA片段化程序推荐
|
插入片段大小 (bp) |
打断程序 |
|
200-300 |
94 °C，10 min |
|
300-400 |
94 °C，7 min |
|
400-500 |
94 °C，5 min |
15. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中，立刻进入第一链cDNA合成。
3.2 第一链cDNA的合成
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
表4 第一链cDNA合成反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
Fragmented mRNA |
17 |
|
Strand Specificity Reagent |
6 |
|
1st Strand Enzyme Mix |
2 |
|
Total |
25 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表5 第一链cDNA合成反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 105 °C |
On |
|
25 °C |
10 min |
|
42 °C |
15 min |
|
70 °C |
15 min |
|
4 °C |
Hold |
3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。
表6 第二链cDNA合成反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
1st Strand cDNA |
25 |
|
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)* |
30 |
|
2nd Strand Enzyme Master Mix |
5 |
|
Total |
60 |
【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的Buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的Buffer。
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。
表7 第二链cDNA合成反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 105 °C |
on |
|
16 °C |
30 min |
|
72 °C |
15 min |
|
4 °C |
Hold |
3.4 接头连接 (Adapter Ligation)
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®接头。
1. 参考注意事项三中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。
表8 Adapter Ligation体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
dA-tailed DNA |
60 |
|
Ligation Enhancer |
30* |
|
Novel T4 DNA Ligase |
5 |
|
DNA Adapter |
5** |
|
Total |
100 |
【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9所示反应程序，进行接头连接反应：
表9 Adapter Ligation反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 |
Off |
|
20 °C |
15 min |
|
4 °C |
Hold |
3.5连接产物纯化(Clean Up Post Ligation)
本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录二的分选方案，通过纯化、分选或者直接分选获得目标长度的文库。
适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）：
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。
9. 吸40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
11. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
12. 重复步骤11，总计漂洗两次。
13. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
14. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。
3.6 文库扩增 (Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表10中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。
表10-A 短接头连接产物PCR反应体系 表10-B 长接头连接产物PCR反应体系
|
组分名称 |
体积(μL) |
组分名称 |
体积 (μL) |
|
|
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
25 |
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
25 |
|
|
Universal Primer/ i5 Primer* |
2.5 |
Primer Mix** |
5 |
|
|
Index Primer/ i7 Primer* |
2.5 |
|||
|
Adapter Ligated DNA |
20 |
Adapter Ligated DNA |
20 |
|
|
Total |
50 |
Total |
50 |
【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂(Cat#12414~ Cat#12415)中配备的Index primer进行扩增。
**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#12615~ Cat#12618)，俗称长接头（大Y接头），可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增。
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11示反应程序，进行PCR扩增。
表11 PCR扩增反应程序
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
98 °C |
1 min |
1 |
|
98 °C |
10 sec |
11~15 cycles * |
|
60 °C |
30 sec |
|
|
72 °C |
30 sec |
|
|
72 °C |
5 min |
1 |
|
4 °C |
Hold |
- |
【注】：*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见表2。
3.7 扩增产物磁珠纯化(Clean Up Post Amplification)
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。
3.8 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。
图2. mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以94 °C 10 min、94 °C 7 min和94 °C 5 min处理。打断后mRNA进行2.2x 磁珠纯化，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。
【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。
分选方案适用于94 °C，10 min、94 °C，7 min和94 °C，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200 bp的文库：
方案一：接头连接产物纯化后分选
0.6× Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。
双轮分选（以94 °C，7 min打断，分选文库大小为410 bp~510 bp为例，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）
当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时，分选比例参照表12进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化，分选比例参照表13进行。
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表12，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL (0.65×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。
室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。
5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL (0.15×)。
6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
9. 重复步骤8。
10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。
11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
表12 短接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度（bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度(bp) |
260~360 |
310~410 |
410~510 |
510~610 |
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打断条件 |
94 °C 10 min |
94 °C 7 min |
94 °C 7 min |
94 °C 5 min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
80 (0.8×) |
75 (0.75×) |
65 (0.65×) |
60 (0.6×) |
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第二轮磁珠体积 (μL) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
10 (0.1×) |
表13 长接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度(bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度(bp) |
320~420 |
370~470 |
470~570 |
570~670 |
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打断条件 |
94 °C 10 min |
94 °C 7 min |
94 °C 7 min |
94 °C 5 min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
75 (0.75×) |
70 (0.7×) |
65 (0.65×) |
60 (0.6×) |
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第二轮磁珠体积(μL) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
10 (0.1×) |
【注】：表12、13推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。
图3. 1 μg 293 total RNA，在94°C 10 min，94°C 7min和94 °C 5 min片段化后，根据表12推荐磁珠比例得到的文库大小
方案二：接头连接产物直接分选（以94 °C，7 min打断，分选文库大小为410 bp~510 bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）
500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。
当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时，分选比例参照表14进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化，分选比例参照表15进行。
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表14，在上述100 μL的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL (0.20×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。
3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。
4. 参考表14向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL (0.10×)。
5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。
6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
8. 重复步骤7。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。
10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
表14 短接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度(bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度(bp) |
260~360 |
310~410 |
410~510 |
510~610 |
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打断条件 |
94 °C 10 min |
94 °C 7 min |
94 °C 7 min |
94 °C 5 min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
25 (0.25×) |
25 (0.25×) |
20 (0.2×) |
18 (0.18×) |
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第二轮磁珠体积 (μL) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
表15 长接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度 (bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度 (bp) |
320~420 |
370~470 |
470~570 |
570~670 |
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打断条件 |
94 °C 10 min |
94 °C 7 min |
94 °C 7 min |
94 °C 5 min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
25 (0.25×) |
20 (0.2×) |
18 (0.18×) |
18 (0.18×) |
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第二轮磁珠体积 (μL) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
图4. 1 μg 293 total RNA，在94 °C 10 min、94 °C 7 min和94 °C 5 min片段化后，根据表14推荐磁珠比例得到的文库大小
HB211206
