WB实验指南！蛋白提取操作指南及注意事项！建议先收藏！

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于蛋白质分析的技术手段，其核心流程包括通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，随后将蛋白转移至固相膜上，并利用特异性抗体（通常为一抗与二抗的复合物）对目标蛋白进行检测。该方法因其高灵敏度和良好的特异性，已成为生命科学研究中应用最广泛的蛋白检测技术之一。在WB实验中，蛋白样品的制备是至关重要的第一步，其质量直接影响后续实验的可靠性和重复性。

蛋白提取的核心在于最大限度地保持目标蛋白的完整性，防止其在提取过程中发生降解。因此，整个操作应在低温条件下进行，并尽量缩短处理时间。此外，针对不同来源的样本（如组织或细胞），需根据其特性选择合适的裂解液和提取方法。

在进行蛋白提取前，研究人员应对目标蛋白的基本信息有充分了解，包括其表达水平、亚细胞定位、分子量范围，以及是否存在可变剪接或翻译后修饰等。这些信息不仅有助于优化蛋白提取策略，还能为后续选择内参蛋白、调整电泳和转膜条件提供依据。

常用裂解液介绍

选择合适的裂解液也是蛋白提取过程中的一个关键步骤。裂解液通常包含缓冲系统、盐离子、表面活性剂和蛋白酶抑制剂等组分，它们各自发挥着不同的作用，共同影响着蛋白提取的效果。因此，在选择裂解液时，我们需要根据目标蛋白的特性以及实验需求进行综合考虑。

货号	名称	主要用途	有效裂解成分	裂解强度	提取膜蛋白	提取胞浆蛋白	提取核蛋白	含蛋白酶抑制剂	含磷酸酶抑制剂
20101ES	RIPA裂解液（强）	WB/IP	1% Triton X-100， 1% Sodium Deoxycholate， 0.1% SDS	强	很好	很好	很好	是	是
20114ES	RIPA裂解液（弱）	WB/IP/Co-IP	1% NP-40， 0.25% Sodium Deoxycholate	温和	一般	很好	较好	是	是
20115ES	RIPA裂解液（中）	WB/IP	1% NP-40，0.5% Sodium Deoxycholate， 0.1% SDS	中	较好	很好	较好	是	是
20118ES	免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液	WB/IP/Co-IP	1% Triton X-100	温和	一般	很好	较好	是	是
20119ES	免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液（无抑制剂）	WB/IP/Co-IP	1% Triton X-100	温和	一般	很好	较好	否	否
20120ES	RIPA裂解液（强,无抑制剂）	WB/IP	1% Triton X-100， 1% Sodium Deoxycholate， 0.1% SDS	强	很好	很好	很好	否	否
20131ES	植物蛋白提取试剂盒	植物WB/IP	1% Triton X-100， 1% Sodium Deoxycholate， 0.1% SDS	强	很好	很好	很好	是	是
20103ES	NP-40(Nonidet P 40)	WB/IP/Co-IP	NP-40纯品，可根据需要配置成1% 的NP-40裂解液或购买成品裂解液（Cat#20121ES），裂解强度温和		一般	很好	较好	/	/
20106ES	SDS	WB	SDS纯品，可根据需要配置成 1%的SDS裂解液，裂解强度强		很好	很好	很好	/	/

特定用途（如质谱检测，需避免AEBSF导致的质谱峰漂移。NO检测，需避免蛋白酶和磷酸酶抑制剂的影响）需要自行添加特定抑制剂或不需要添加抑制剂时，可以考虑选购20119ES或20120ES。

常见的裂解液除了其中的有效裂解成分以外，还含有比较复杂的缓冲体系。以常见的RIPA裂解液成分为例：Tris-HCl是常见的缓冲体系之一，为蛋白提供稳定的环境(7.4是接近生理状态的PH值)；接近生理状态浓度的NaCl有利于保持蛋白的溶解状态，不会破坏蛋白及蛋白间的相互作用；少量的EDTA可以螯合金属离子抑制蛋白酶活性；SDS是一种裂解能力很强的阴离子表面活性剂，高浓度的SDS会破坏蛋白的天然构象使其变性，溶液中盐离子强度越强，SDS的破坏作用越强；Sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠)是一种阴离子表面活性剂，作用较SDS弱；Triton X-100是一种非离子型表面活性剂不会使蛋白变性，也不会破坏蛋白与蛋白之间的相互作用，但可破坏蛋白质与脂质之间的相互作用。

常见酶抑制剂介绍

此外，选择裂解液时还需考虑其对膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白的提取效果，以及是否含有蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂。同时，不同物种的样品兼容性也是选择裂解液时需要考虑的因素。

货号	名称	规格	组分	用途
20123ES	蛋白酶抑制剂Cocktail， EDTA-free，迷你型，片剂	1瓶（10片）/1瓶（50片）	包含AEBSF、Aprotinin、 Bestatin、 E-64、Leupeptin、 Pepstatin A多种成分	哺乳动物细胞或组织抽提蛋白用
20124ES	蛋白酶抑制剂Cocktail, EDTA-free,100×DMSO储液	1 mL/10×1 mL/100×1 mL	包含AEBSF、Aprotinin、 Bestatin、 E-64、Leupeptin、 Pepstatin A多种成分	哺乳动物细胞或组织抽提蛋白用
20134ES	蛋白酶抑制剂Cocktail （用于真菌或酵母提取）, EDTA-free, 100×DMSO储液	1 mL	包含AEBSF、E-64、 Pepstatin A、 1,10-phenanthroline	真菌或酵母抽提蛋白用
20135ES	蛋白酶抑制剂Cocktail （用于His-Tag蛋白纯化）, EDTA-free, 100×DMSO储液	1 mL	包含AEBSF、 Bestatin、E-64、 Pepstatin A、 Phosphoramidon Disodium Salt	His-Tag蛋白裂解及镍柱纯化用
20136ES	蛋白酶抑制剂Cocktail （用于植物样本提取）, EDTA-free, 100×DMSO储液	1 mL	包含AEBSF、Bestatin、 E-64、Leupeptin、 Pepstatin A、1,10-Phenanthroline	植物细胞或组织抽提蛋白用
20137ES	蛋白酶抑制剂Cocktail （用于细菌提取）,100×储液	2 mL	包含AEBSF、 Bestatin、E-64、 Pepstatin A和单独包装的EDTA	细菌抽提蛋白用
20138ES	蛋白酶抑制剂Cocktail （质谱兼容）,50×储液	2 mL	包含Aprotinin、Bestatin、E-64、 Leupeptin 和单独包装的EDTA	质谱分析的细胞或组织样品的蛋白抽提
20109ES	磷酸酶抑制剂混合物 (100×,储存液)	2 mL/10×2 mL/100×2 mL	A管含有Cantharidin、 Bromotetramisole、 Microcystin-LR。 B管含有Sodium orthovanadate、 Sodium molybdate、 Sodium tartrate、Imidazole 、 Sodium Fluoride。	广谱抑制非特异性的酸性/碱性磷酸酶以及特异性的蛋白酪氨酸磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PPA，PP2A）等
20140ES	去乙酰化酶抑制剂 Cocktail (100× in 70% DMSO)	1 mL	包含Trichostatin A、 EX-527、 Nicotinamide、 Sodium Butyrate	用于保持蛋白质的乙酰化状态。

蛋白提取注意事项

防止蛋白降解：在蛋白提取过程中，应尽量避免样品暴露于蛋白酶活性较高的温度环境。对于来源于哺乳动物的组织或细胞样本，整个制备流程需在低温条件下进行，以最大限度抑制蛋白酶的活性，防止目标蛋白被降解。

组织采集顺序与处理建议：取样时应遵循一定的顺序，优先处理消化腺相关组织（如肝脏、胰腺）及消化道器官（如胃、小肠、大肠），以及富含免疫细胞的组织（如肺）。随后再采集生殖系统组织（如卵巢、子宫、睾丸），最后处理心脏、脾脏、肾脏和脑等器官。若组织不能立即用于实验，应迅速置于液氮中冷冻或转移至−80°C保存。需特别强调的是，尽量使用新鲜组织进行蛋白提取，尤其是消化系统来源的样本，因其在WB检测中通常信号更强、背景更低。若样品经历反复冻融，应弃用，以免影响实验结果。

细胞样本处理注意事项：某些细胞系内源性蛋白酶活性较高，提取时应尽量缩短操作时间，并可选用含高浓度SDS的裂解液，以加快裂解过程并抑制酶活性。

胰蛋白酶对膜蛋白提取的影响：若实验目标为膜蛋白，需警惕胰蛋白酶可能引起的蛋白剪切效应。在细胞传代过程中，胰酶处理可能导致膜蛋白被切割，从而在WB中出现非特异性条带或信号缺失。因此，建议最后一次传代时控制细胞密度，给予细胞充分时间恢复膜蛋白表达。收集贴壁细胞时，推荐采用直接裂解后刮取的方式，或先刮取细胞再进行裂解，尽量避免使用胰酶消化步骤。

减少杂质干扰：

蛋白提取物中常含有杂质，这些杂质会影响后期电泳分离的效果。为了优化这一步骤，可以采取以下措施：

杂质类型	解决方法
外源蛋白	所有试验器具需洁净;贴壁细胞不用胰蛋白酶消化
核酸（使上清粘稠，蛋白上样困难）	用超声或1 mL注射器断裂DNA从而与蛋白分开。或加入全能核酸酶（Cat#20156ES）切断核酸。
油脂	吸取蛋白时应小心避开油脂或先将油脂吸去
盐离子	盐离子浓度过高将导致“微笑”带；相同分子量蛋白条带高低不一可能因为样品中盐离子浓度差别过大。盐离子浓度不宜过高，各样品之间离子浓度应保持一致

细胞/组织破碎是蛋白质提取的关键环节，常用的破碎方法包括机械破碎、超声波破碎以及化学溶解等。选择适合的方法对样品进行破碎，并确保破碎效果彻底。

总蛋白溶液可用于检测细胞中大多数蛋白的表达情况。若需要分离特定细胞器的特异蛋白，可以选用专门的蛋白分离试剂盒进行处理。

使用PMSF等蛋白酶抑制剂时需注意防护，因为这些物质可能对呼吸道、眼睛和皮肤造成损害。

提取得到的蛋白样品应及时分装，并长期保存在-80℃环境中，以避免样品反复冻融。

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