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干货 | 一文科普,NGS测序技术不同,所需测序深度也不同!

NGS测序,又称为下一代测序技术或者高通量测序技术。只要涉及到测序,就伴随着测序仪以及对应的测序深度。

 

 

那么何谓测序深度呢?

测序深度(Sequencing Depth)是指对目标区域(如全基因组或者某个特定基因片段)进行测序时,碱基被覆盖的平均次数。通常用“X”表示覆盖深度,如10X表示目标区域的每个碱基被平均测序了10次。

 

测序深度通常是通过生信分析手段来进行统计。而我们普遍在测序时poling的文库,是按照测序数据量来进行计算的。

 

 

测序数据量与目标区域大小和测序深度有对应的关系

测序数据量是指整个测序过程中生产的总碱基对的数量,通常用Gb或者Mb作为单位,如测序时,要测6 Gb,那么下机时的reads数乘以测序模式如PE150,则用300 bp/条来进行计算,如PE150测序,下机reads数为100,000条,则粗略估算测序量为100,000 *300 /1000000=30 Mb

 

 

测序数据量与测序深度和目标区域大小的计算公式为:

测序数据量=目标区域大小×测序深度

如全基因组测序,一般要求测序深度30 X,而该目标区域是人的全部基因组区域,3 Gb,那么此时要求的测序数据量为3×30 =90,即全基因组测序需要测到90 G以上。

 

 

那么为什么不同的技术有不同的测序深度要求呢?

测序深度是考虑技术的特殊性:

  • 可靠性提升:测序深度越高,能够减少因测序错误或者随机性导致的假阳性。

  • 检测突变灵敏度:高深度测序有利于发现低频突变如肿瘤中的亚克隆变异。

  • 不同的测序技术需要平衡成本与精度:测序深度越高,测序成本越高,但是高深度测序可能会导致收益递减。

 

不同的测序技术,测序深度要求如下:

测序技术

应用

推荐测序深度或reads数

参考文献

WGS

SNVs检测(纯合)

15X

Bentley et al., 2008

SNVs检测(杂合)

33X

Bentley et al., 2008

Indels检测

60X

Feng et al., 2014

基因型分析

35X

Ajay et al., 2011

CNV检测

1-8X

Xie et al., 2009; Medvedev at al., 2010

全外显子测序

SNVs检测(纯合)

100x (3x local depth)

Clark et al., 2011; Meynert et al., 2013

SNVs检测(杂合)

100x (13x local depth)

Clark et al., 2011; Meynert et al., 2013

Indels检测

/

Feng et al., 2014

转录组测序

基因表达检测

10~25 M

Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq

可变剪接检测

50~100 M

Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq

等位基因特异性表达

50~100 M

Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq

无参转录本组装

50~100 M

Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq

DNA互作检测

ChIP-seq

10~14 M(窄峰模式)
20~ 40 M(宽峰模式)

Rozowsky et al., 2009; ENCODE 2011 Genome; Landt et al., 2012

CUT&Tag

5~10 M

Henikoff etal.,2019

ATAC-seq

15 M (单端测序)
50 M(双端测序)

ENCODE ATAC-Seq

Hi-C

100 M

Belton, J.M et al., 2012

4C

1~5 M

van de Weken, H.J.G. et al., 2012

5C

15~25 M

Sanyal A. et al., 2012

ChIA-PET

15~20 M

Zhang, J. et al., 2012

FAIRE-seq

25~55 M

ENCODE 2011 Genome; Landt et al., 2012

DNase-seq

25~55 M

Landt et al., 2012

DNA甲基化测序

CAP-seq

>20 M

Long, H.K. et al., 2013

MeDIP-seq

60 M

Taiwo, O. et al., 2012

RRBS

10X

ENCODE 2011 Genome

BS-seq

5-15X; 30X

Ziller, M.J et al., 2015; Epigenomics Road Map

RNA互作研究

CLIP-seq

10~40 M

Cho J. et al., 2012; Eom T. et al., 2013; Sugimoto Y. et al., 2012

iCLIP

5~15 M

Sugimoto Y. et al., 2012; Rogelj B. et al., 2012

PAR-CLIP

5~15 M

Rogelj B. et al., 2012

 

RIP-seq

5~20 M

Lu Z. et al., 2014

Small RNA测序

差异鉴定

1~2 M

Metpally RPR et al., 2013; Campbell et al., 2015

鉴定small RNA

5~ 8 M

Metpally RPR et al., 2013; Campbell et al., 2015

 

 

 

 

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