NGS测序,又称为下一代测序技术或者高通量测序技术。只要涉及到测序,就伴随着测序仪以及对应的测序深度。
那么何谓测序深度呢?
测序深度(Sequencing Depth)是指对目标区域(如全基因组或者某个特定基因片段)进行测序时,碱基被覆盖的平均次数。通常用“X”表示覆盖深度,如10X表示目标区域的每个碱基被平均测序了10次。
测序深度通常是通过生信分析手段来进行统计。而我们普遍在测序时poling的文库,是按照测序数据量来进行计算的。
测序数据量与目标区域大小和测序深度有对应的关系
测序数据量是指整个测序过程中生产的总碱基对的数量,通常用Gb或者Mb作为单位,如测序时,要测6 Gb,那么下机时的reads数乘以测序模式如PE150,则用300 bp/条来进行计算,如PE150测序,下机reads数为100,000条,则粗略估算测序量为100,000 *300 /1000000=30 Mb
测序数据量与测序深度和目标区域大小的计算公式为:
测序数据量=目标区域大小×测序深度
如全基因组测序,一般要求测序深度30 X,而该目标区域是人的全部基因组区域,3 Gb,那么此时要求的测序数据量为3×30 =90,即全基因组测序需要测到90 G以上。
那么为什么不同的技术有不同的测序深度要求呢?
测序深度是考虑技术的特殊性:
-
可靠性提升:测序深度越高,能够减少因测序错误或者随机性导致的假阳性。
-
检测突变灵敏度:高深度测序有利于发现低频突变如肿瘤中的亚克隆变异。
-
不同的测序技术需要平衡成本与精度:测序深度越高,测序成本越高,但是高深度测序可能会导致收益递减。
不同的测序技术,测序深度要求如下:
测序技术 |
应用 |
推荐测序深度或reads数 |
参考文献 |
WGS |
SNVs检测(纯合) |
15X |
Bentley et al., 2008 |
SNVs检测(杂合) |
33X |
Bentley et al., 2008 |
|
Indels检测 |
60X |
Feng et al., 2014 |
|
基因型分析 |
35X |
Ajay et al., 2011 |
|
CNV检测 |
1-8X |
Xie et al., 2009; Medvedev at al., 2010 |
|
全外显子测序 |
SNVs检测(纯合) |
100x (3x local depth) |
Clark et al., 2011; Meynert et al., 2013 |
SNVs检测(杂合) |
100x (13x local depth) |
Clark et al., 2011; Meynert et al., 2013 |
|
Indels检测 |
/ |
Feng et al., 2014 |
|
转录组测序 |
基因表达检测 |
10~25 M |
Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq |
可变剪接检测 |
50~100 M |
Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq |
|
等位基因特异性表达 |
50~100 M |
Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq |
|
无参转录本组装 |
50~100 M |
Liu Y. et al., 2013; ENCODE 2011 RNA-Seq |
|
DNA互作检测 |
ChIP-seq |
10~14 M(窄峰模式) |
Rozowsky et al., 2009; ENCODE 2011 Genome; Landt et al., 2012 |
CUT&Tag |
5~10 M |
Henikoff etal.,2019 |
|
ATAC-seq |
15 M (单端测序) |
ENCODE ATAC-Seq |
|
Hi-C |
100 M |
Belton, J.M et al., 2012 |
|
4C |
1~5 M |
van de Weken, H.J.G. et al., 2012 |
|
5C |
15~25 M |
Sanyal A. et al., 2012 |
|
ChIA-PET |
15~20 M |
Zhang, J. et al., 2012 |
|
FAIRE-seq |
25~55 M |
ENCODE 2011 Genome; Landt et al., 2012 |
|
DNase-seq |
25~55 M |
Landt et al., 2012 |
|
DNA甲基化测序 |
CAP-seq |
>20 M |
Long, H.K. et al., 2013 |
MeDIP-seq |
60 M |
Taiwo, O. et al., 2012 |
|
RRBS |
10X |
ENCODE 2011 Genome |
|
BS-seq |
5-15X; 30X |
Ziller, M.J et al., 2015; Epigenomics Road Map |
|
RNA互作研究 |
CLIP-seq |
10~40 M |
Cho J. et al., 2012; Eom T. et al., 2013; Sugimoto Y. et al., 2012 |
iCLIP |
5~15 M |
Sugimoto Y. et al., 2012; Rogelj B. et al., 2012 |
|
PAR-CLIP |
5~15 M |
Rogelj B. et al., 2012 |
|
|
RIP-seq |
5~20 M |
Lu Z. et al., 2014 |
Small RNA测序 |
差异鉴定 |
1~2 M |
Metpally RPR et al., 2013; Campbell et al., 2015 |
鉴定small RNA |
5~ 8 M |
Metpally RPR et al., 2013; Campbell et al., 2015 |
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