表观遗传

1942 年，Conrad Waddington 创造出了“表观遗传学”一词，用以定义基因型未发生改变而表型改变的现象，以解释发育的各个方面。大约 3/4 个世纪以后，我们发现基因表达模式传递的表观遗传机制并不依赖于 DNA 序列的改变，而是通过改变染色质的状态，而染色质状态同时是我们遗传信息的生理学形式。表观遗传的调控机制包括多种方式，图1主要介绍其中的3种：DNA甲基化、组蛋白修饰（图1中显示乙酰化和甲基化修饰）和非编码RNA介导的调控。

表观遗传与人类疾病

DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等表观遗传因素，与肿瘤发生、免疫缺陷病、神经系统疾病、心血管疾病和精神疾病等多种疾病相关。DNA甲基化就像一顶“神奇的帽子”，在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用。

肿瘤

正常的DNA甲基化模式如果被破坏(如基因启动子区域的甲基化程度过高或过低)都会导致细胞的癌变。

免疫缺陷疾病

ICF综合征,是由DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因突变而引起的。患者1号、9号和16号染色体异常，在其着丝粒附近具有大量重复的典型卫星DNA序列，这些重复序列表现为低甲基化。

精神类疾病

瑞特综合征是由于X染色体上编码MeCP2转录因子的基因突变导致的。MeCP2突变导致该基因调节DNA甲基化的过程异常，从而致病。

甲基化研究分类

根据甲基化作用的对象不同，可以将甲基化分为：DNA甲基化、RNA甲基化以及蛋白质甲基化。

DNA甲基化

DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位等，它们分别由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。目前对于DNA甲基化的研究主要关注点在5mC以及6mA，甲基化研究技术也分为WGBS（研究5mC）、RRBS（研究5mC）、MeDIP（研究5mC）、6mA（研究6mA）等。其中，WGBS和RRBS能定位到单碱基分布的甲基化研究，MeDIP以及6mA主要基于特异性的甲基化修饰位点结合抗体来识别DNA甲基化区域，具有实验简单、成本较低等优点。

表.不同DNA甲基化技术对比

技术	WGBS	RRBS	MeDIP-seq	6mA-IP-seq
研究对象	5mC	5mC	5mC	6mA
原理	Bisulfite 转换	Bisulfite 转换	抗体富集	抗体富集
分辨率	单碱基分辨率	单碱基分辨率	200 bp-300 bp	200 bp-300 bp
覆盖范围	全基因组	主要集中于 promoters 和 CpG 岛	可以检测全基因组任何位置的甲基化区域，但是倾向于高 CpG 密度区域	/
鉴定 DMR 的数量	多	多	少	/
DMRs 的灵敏度	高	高	低	/
测序量	30×	10 G	20-30 M clean reads	20-30 M clean reads
有效 CG 位点比例	70%-80%	10%-15%	/	/

RNA甲基化

已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。RNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。目前RNA甲基化的研究主要在m6A和m5C上，对应的RNA甲基化研究技术为MeRIP（m5C）、m6A（m6A）等。这两种技术都是基于特异性识别核酸修饰的抗体进行靶向富集，两种技术都是非单碱基研究。

目前已经有很多技术来解决RNA甲基化单碱基分布的问题，2024年1月2日，芝加哥大学何川教授团队在Nature Biotechnology上在线发表了题为Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5‑methylcytosine in DNA and RNA的研究论文，该研究提出并开发了对DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修饰进行快速，准确检测的测序方法，简称为UBS-seq。该技术提出的5 min快速转化试剂盒，能够减少传统化学转化方法对RNA的损伤。

翌圣生物的Hieff^® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技术开发优化而成，可以在98°C 5min条件下可完成＞99.5%的胞嘧啶转化，并且极大的降低了DNA损伤，更好的保证了DNA片段的完整性。

图. Superfast DNA Methylation Bisulfite的技术原理及优势

Hieff^® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）将DNA变性与亚硫酸氢盐转化融合为一步，5分钟内即可完成转化，约30 min可完成BS转化全流程。采用柱内脱硫技术，使操作流程更为简单；可以满足100 pg-2 μg样品的转化；未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的转化率≥99%；转化后的产物适用于PCR扩增和DNA测序等下游应用。

图4.Superfast BS转化实验流程

客户案例

客户A：使用12225与竞品Z转化试剂盒进行头对头对比，转化样本为15 ng 甲基化puc19+非甲基化λ DNA混合物，转化后的样本采用甲基化单链DNA建库，如图5所示：12225文库产量和对比率优于竞品Z，转化效率和竞品Z相当。

蛋白质甲基化

蛋白质甲基化是真核生物中普遍存在且关键的翻译后修饰 (PTM)，主要发生在赖氨酸残基和精氨酸残基上。常见的组蛋白甲基化修饰有H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3以及H3K36me3等，不同的组蛋白修饰起不同的作用。组蛋白H3K4 （H3K4me1 和 H3K4me3）上的单甲基化和三甲基化都是活化标志物，但是也有着特殊的细微差别：H3K4me1 通常会标记转录增强子，而 H3K4me3 则标记基因启动子。同时，K36 (H3K36me3) 的三甲基化是与基因转录区域相关的活化标志物。H3K27me3启动子区域的一个临时信号、H3K9me3是在具有串联重复结构的基因贫乏染色体区域形成异染色质的永久信号，如卫星重复序列、端粒和近着丝粒区。其中，H3K27me3位于基因间和沉默的编码区，H3K9me3主要位于活性基因的编码区。对于蛋白质甲基化有组蛋白甲基化研究CUT&Tag、ChIP-seq、CUT&RUN或者蛋白质修饰组的质谱研究。

表.CUT&Tag、ChIP-seq及CUT&RUN技术对比

CUT&Tag	ChIP-seq	CUT&RUN
胞内反应	*胞内反应	胞内反应
收集细胞，无需特殊处理	甲醛交联	收集细胞，无需特殊处理
ConA磁珠与细胞孵育	细胞破碎裂解，超声打断gDNA	ConA磁珠与细胞孵育
一抗二抗结合目的蛋白	一抗结合目的蛋白	一抗二抗结合目的蛋白
转座酶复合体结合二抗，激活反应	免疫沉淀	MNase酶复合体结合二抗，激活反应
磁珠回收DNA片段	洗脱，解交联，获得DNA片段	纯化获得DNA片段
一步法PCR扩增文库	多步反应：修复加A，加接头，PCR扩增	多步反应：修复加A，加接头，PCR扩增
产物纯化，上机测序	产物纯化，上机测序	产物纯化，上机测序
总时长：7.5 hour	总时长：3-5 Day	总时长：1-2 Day

欲知DNA甲基化、RNA甲基化以及蛋白质甲基化如何进行关联研究，请关注翌圣生物下回分晓。

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