Hieff^® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析（如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等），无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的荧光定量qPCR模块，为补充试剂。

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

1. 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
2. 将细胞转移至离心管中*，5000 rpm离心2 min收集细胞**，充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。
3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗细胞，5000 rpm离心2 min，吸尽FCD Washing Buffer。
4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室温吸打混匀后静置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右，即可得到裂解产物****，细胞数量超过1× 10⁵ cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 10² - 1× 10⁵ cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-25~-15℃。

二、反转录

1. 室温融化4× Hifair^® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分	体积 （μL）	终浓度
4× Hifair® FCD RT Mix	5	1×
裂解产物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片，推荐使用量为2 μl，最大不超过反应体系的55%。

2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应**：

反应温度	反应时间
37℃	5 min
85℃	5 sec

表2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃，反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值（10-35），可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-25~-15℃保存。

三、荧光定量PCR

1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液（配制过程请于冰上进行）：

组分	体积（μL）	终浓度
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix	12.5	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	200 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	200 nM
Probe (10 μM)	0.25-1	100-400 nM
反转录产物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 25	-

表3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增，可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

2. 荧光定量PCR快速扩增程序（推荐）

本产品推荐使用快速程序扩增，可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时，可额外调整退火温度。

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 sec	1
变性	95℃	5 sec	45
退火/延伸**	60℃	10 sec

表4 qPCR反应程序（快速）

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

3. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时，也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 sec	1
变性	95℃	15 sec	40-45
退火/延伸**	60℃	30 sec

表5 qPCR反应程序（常规）

 

注意事项

1. 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
2. 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
3. 本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20231207