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COA
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本产品适用于多重PCR实验。2×Hieff® Multiplex PCR Master Mixfor Pathogen以热启动多重Taq酶制剂与2×扩增缓冲液为组分配置成预混液。本预混液可快速便捷地用于多重PCR反应，扩增子GC含量25-75%范围内可以有效扩增。具备高均一性、高特异性和高灵敏度的特点。本试剂适用于30~300对以内不同大小片段的多重扩增，也可用于进行数千重及以上扩增子的捕获。
运输与保存方式
冰袋运输。-25 ~ -15℃储存，有效期2年。
实验流程
- 推荐反应体系：
一轮反应程序
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen |
15 |
1× |
|
Primer mix |
x |
0.02 μM-0.5 μM |
|
模板DNA |
x |
1 ng-400 ng |
|
无菌超纯水 |
x |
- |
|
总体积 |
To 30 |
|
【注】
1）上表中DNA量和引物浓度均为推荐用量和浓度，可根据具体实验情况进行调整最适浓度。
2）参考建议：每条引物的浓度可在0.02 μM-0.5 μM范围内进行调整。
3）预混液中已经包含扩增所需要的酶、dNTP、盐离子等，无需额外添加。
二轮反应程序
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen |
15 |
1× |
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Primer Index mix |
4（6pmol） |
|
|
一轮纯化产物 |
11 |
|
|
无菌超纯水 |
x |
- |
|
总体积 |
To 30 |
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- 推荐反应程序：
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循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
3 min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
30 sec |
X |
|
退火 |
60℃ |
30 sec |
|
|
延伸 |
72℃ |
30 sec |
|
|
终延伸 |
72℃ |
3 min |
|
|
暂存 |
4℃ |
- |
1 |
【注】
1）退火时间可以根据Panel种类不同，进行适当延长，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;
2）延伸时间以最长片段为准。延伸时间太长会导致非特异性扩增增多，可通过缩短延伸时间来提高扩增特异性，延伸时间不少于30 sec。
3）针对模板含量较低的样本，可通过增加循环数提高扩增产出。
- 循环数推荐：
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单管引物重数 |
推荐循环数 （10 ng gDNA ） |
退火延伸时间 |
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一轮 |
二轮 |
||
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10-50 |
10~28 |
18~28 |
30 s~2 min |
|
50-200 |
10~28 |
16~28 |
30 s~2 min |
|
200-800 |
10~28 |
14~28 |
30 s~2 min |
|
800以上 |
10~28 |
12~28 |
30 s~4 min |
【注】
上表是基于10 ng gDNA进行的一轮及二轮循环数的推荐；当投入量大于10 ng，二轮的相应的循环数可以减少；当投入量小于10 ng，一，二轮的相应的循环数要相应的增加。
- 多重扩增引物纯化
一轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化
1) 准备工作：将 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮 PCR 产物中，室温孵育 5 min。
4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重复步骤 5，总计漂洗两次。
7) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过 5min）。
8) 直接加入 11 μL ddH2O，将 PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。进入下一步反应。
二轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化
1) 准备工作：将 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮 PCR 产物中，室温孵育 5 min。
4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重复步骤 5，总计漂洗两次。
7) 磁珠晾干后，将PCR管从磁力架上取下，加入30 µL Nuclease-free ddH2O覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀。室温孵育2 min。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。
8）将PCR管短暂离心收集后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清(约5 min)。 小心吸取25 µl上清转移至新的EP管中，继续进行下一步反应。
HB230308
