本试剂盒可直接快速地对小鼠组织（如鼠尾、鼠耳、鼠趾等）样本进行PCR扩增，具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液，可以快速裂解样品，释放基因组DNA。裂解产物可以直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，2-5 mm2鼠耳或肝脏、1-5 mm鼠尾、1-2个脚趾均可进行实验。

本试剂盒提供的2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

该试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

 

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		10189ES20 （20 T）	10189ES50 （50 T）	10189ES70 （200 T）	10189ES76 （500 T）
10189-A	Lysis solution a	5 mL	12 mL	4× 12 mL	10× 12 mL
10189-B	Proteinase K (20 mg/ml)	250 μL	625 μL	2× 1.25 mL	5× 1.25 mL
10189-C	2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix b	500 μL	1.25 mL	5× 1 mL	10× 1.25 mL

a) Lysis solution为裂解液，请戴手套操作。
b) 2× Hieff^® Tissue Direct PCR Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、4 mM Mg²⁺、PCR反应增强剂、稳定剂等。

 

运输方法

干冰运输。

 

保存方法
1. 组分A：2-8℃保存，有效期1年。若长时间多次使用，请分装后储存，避免交叉污染。
2. 组分B/C：-20℃保存，避免反复冻融。有效期1年。

 

操作方法

样品基因组DNA释放

1. 剪取2-5 mm²鼠耳或肝脏组织，或1-5 mm鼠尾、或1-2个脚趾，置于1.5 mL离心管中；

2. 在上述离心管中加入200 μL Lysis solution和10 μL Proteinase K，轻轻涡旋混匀，使得样品完全被浸润，短暂离心；

3. 在恒温孵育仪中70℃孵育10 min；

4. 孵育完成后，将样品置于95℃或者沸水浴中加热5 min灭活Proteinase K;

5. 将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12000 rpm (13400× g)离心10 min；

6. 将上清转移至新的离心管，-20℃保存不超过48小时或直接取上清用于后续PCR扩增。

【注】：1. 组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。

2. 70℃孵育，一般10 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至20-30 min。组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

PCR反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix	25	1×
Forward Primer (10 μM)	2	0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)	2	0.4 μM
裂解产物	1-5	-
ddH2O	补足至 50 μL	-

【注】：各组分使用前应充分混匀。
a) 模板使用量：50 μL体系建议初步采用2 μL上清液作为模板起始投入量，若产物量较少，可适当增加模板投入量；
b) 引物终浓度：0.2-0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度；
c) 反应体系：推荐使用50 μL，也可根据使用习惯调整体系体积大小；
d) 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

PCR反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	35
退火	60℃	15 sec
延伸	72℃	3-10 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

【注】：a) 退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。

b) 延伸时间：1-4 kb用3-10 s/kb，4 kb以上用20 s/kb。

c) 扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。

d) 电泳上样：取5-7 μL扩增产物上样即可。

对照反应

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性（小鼠基因组DNA）和阴性（通常为生理盐水）PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

注意事项
1. 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液或75%酒精中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。

2. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
3. 建议扩增片段长度6 kb以内，以便扩增效率最佳。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5. 本产品仅作科研用途！

 

常见问题与解决方法

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× Mouse Direct PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系1-10%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

HB220926