Blood Advanced Direct PCR Kit是一款可直接对全血样本进行PCR扩增而无需进行DNA纯化或样本预处理的试剂盒，兼容含EDTA、肝素、柠檬酸盐等常规抗凝剂的新鲜血液、冷藏（冻）血液及Whatman903^®和FTA^®商用干血渍。试剂盒中含有经过经基因工程改造的DNA Polymerase组合，具有保真性高、对PCR抑制剂耐受性强的特点，2× Hieff^® Blood Advanced PCR Buffer中添加强力延伸因子、扩增增强因子以及优化的缓冲体系，能够在快速延伸条件下高效扩增8 kb的基因组片段，对于2 kb以下的片段，设置3-5 sec/kb延伸时间即可完成扩增，从而大幅缩短血液样本的鉴定及检测时间。

       Hieff^® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix的扩增产物的3’端为平末端，适用于一步法快速克隆及TOPO克隆试剂盒（Yeasen CAT# 10907/10908/10909/10910/10911/10912/10922）。
  试剂盒中提供的引物预混液Positive control primer mix (10 μM each)能够从哺乳动物和大多数脊椎动物的sox21基因上游保守序列中扩增出长度237 bp的片段，可作为阳性对照使用。

 

产品组分

编号	名称	10188ES20	10188ES50	10188ES60	10188ES76
10188-A	2× Hieff® Blood Advanced PCR Buffer	500 μL	1.25 mL	2.5 mL	12.5 mL
10188-B	Hieff® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix	20 μL	50 μL	100 μL	500 μL
10188-C	Positive control primer mix (10 μM each)	100 μL	100 μL	200 μL	500 μL
10188-D	10× DNA loading buffer	1 mL	1 mL	1 mL	1 mL × 5

 

运输与保存方式

干冰运输。-20℃保存，有效期1年。

 

适用范围

不同类型的全血样本直接PCR反应。

 

注意事项

1. 推荐血液模板使用量为反应总体积的10%，即50 μL反应体系中加入5 μL全血作为模板，注意避免吸取血液凝块。
2. 延伸时间10 sec/kb可扩增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可扩增大部分2 kb以下片段。若扩增效率较低，可适当延长时间至30 sec/kb。
3. PCR反应结束后，推荐将反应产物于4000 rpm (1000× g) 离心1-3 min以沉淀血细胞碎片，取上清进行下游分析。
4. 本产品不可直接用于医疗诊断。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

PCR反应体系^a

组分	体积
ddH2O	to 50 μL
2× Hieff® Blood Advanced PCR Buffer	25 μL
Forward Primer (10 μM) b	2 μL
Reverse Primer (10 μM) b	2 μL
Hieff® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix	1 μL
血液样本c	X

^a 使用前请充分混匀各组分。

^b 推荐每条引物的使用终浓度为0.4 μM，过高会导致非特异性扩增。

^c 最佳全血模板浓度范围为0.5%-20%，推荐使用量为10%作为初始尝试条件，即50 μL反应体系中加入5 μL全血作为模板，注意避免吸取血液凝块。对于贮存在Whatman^®滤纸卡上的干血渍，则可取约1 mm²带血渍的圆纸片，无需进行预处理，直接放入PCR反应液中即可进行扩增。

PCR反应条件

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	30-35
退火a	60℃	15 sec
延伸b	72℃	3-10 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

^a 退火温度为通用Tm值或低于引物Tm值1-2℃。如果扩增产物特异性较差，可以建立退火温度梯度以寻找最佳退火条件。

^b 延伸时间10 sec/kb可扩增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可扩增大部分2 kb以下片段。若扩增效率较低，可适当延长时间至20-30 sec/kb，不应超过60 sec/kb。

PCR产物分析
PCR反应结束后，推荐将反应产物于4000 rpm (1000× g) 离心1-3 min以沉淀血细胞碎片，取上清进行下游分析。该步骤可消除全血中多种残留成分对电泳检测的干扰，对使用高浓度血液作为模板的PCR产物尤为必要。通常，5 μL/50 μL (10%)反应产物可取30-35 μL上清，3 μL/50 μL (5%)反应产物可取40-45 μL上清。若需对PCR产物进行其它分析，例如酶切等，应将产物稀释2-4倍以降低反应中的盐及其它抑制剂对反应的干扰。

对照反应
试剂盒内提供引物预混液Positive Control Primer Mix (10 μM each) 用于阳性对照反应。可从哺乳动物及其他许多脊椎动物的基因组sox 21基因上游序列中扩增出237 bp的片段，该扩增区是一段高度保守的非编码区。
Primer F: 5'- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3'   
Primer R: 5'- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3'

 

常见问题与解决方案

无扩增产物或产量少	产物呈现高分子量弥散条带	产物呈现低分子量弥散条带
检查引物设计，确认引物浓度和纯度	提高退火温度或设置退火梯度	电泳前离心取上清
重复实验，确认体系、程序无误	延伸时间不应过长	提高退火温度或设置退火梯度
增加循环数	尝试不同的血液用量	尝试不同的血液用量
优化退火温度	减少循环数	减少循环数
尝试不同的血液用量	降低引物浓度	降低引物浓度
重新设计引物		重新设计引物

HB220617