5×Hifair^® Ⅲ Buffer 可与Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase (Cat#14601)配套使用，为逆转录创造最佳条件。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		15662ES03	15662ES08	15662ES50
15662-A	5×Hifair® Ⅲ Buffer	1 mL	5 mL	50 mL

 

产品应用

全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

 

注意事项

1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。

2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解。

3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

 

第一链cDNA合成操作步骤

1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）

组分	使用量
RNase-free H2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM)   or Gene Specific Primers (2 μM)	1 μL
	or 1 μL
	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng

65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	13 μL
5×Hifair® Ⅲ Buffer	4 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (800 U/μL) (Cat#14601)	200 U
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略；

2）逆转录温度：推荐使用55℃；对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃；

3) 可将逆转录时间延长到45-60min，有助于提高产量；

4）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。

※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

HB220615