文献题目：RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids

中文题目：直接作用于切割RNA/DNA杂合链的RNA测序方法

发表时间：2020.1.27

发表期刊：PNAS

影响因子：9.58

合作单位：北京大学、清华大学

关键词：RNA-Seq、Tn5转座酶、SHERRY、ScRNA、SMART-Seq 

 

背景简介 

RNA测序（RNA-seq）在基因表达差异分析方面的应用来说颇为成熟，主要包括目标RNA富集及片段化、一链和二链cDNA合成、PCR扩增等几个主要流程。其中二链cDNA的合成是获得高质量文库的关键，但二链cDNA的合成需要引入额外的DNA聚合酶，可能导致测序的偏好性增加。

近日，北京大学的黄岩谊和谢晓亮研究团队联合清华大学王建斌研究团队在美国《国家科学院院刊》(PNAS)发表了一篇名为“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”，介绍了一种新的基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法，不仅可以消除常规RNA-seq需要cDNA二链合成的繁琐性而且极大的突破了Tn5仅在DNA上作用的限制，大大拓展了Tn5转座酶的应用范围。

 

文章方法及主要内容

1.样本处理：

1）Tn5转座酶和Tn5 D188E突变株的制备、纯化。

2）HEK293T和HeLa细胞培养、总RNA提取和纯化mRNA。

3）单细胞制备。

 

2.研究内容：

1）Tn5转座酶通过作用于RNA/cDNA杂合链用于RNA-seq

Tn5、RNase H和 MMLV逆转录酶的结构比对和分子对接的结果表明Tn5能够作用于RNA/DNA杂交双链。随后将Tn5应用在HEK293T提取的mRNA/cDNA杂合链上，并进一步PCR扩增，片段化的RNA/cDNA杂合链和扩增产物的大小分布显示，扩增后的产物分布比片段化的产物长100-150 bp左右。因此Tn5可作用于RNA/DNA杂合双链同时应用于RNA-Seq快速建库方法。

图1.Tn5转座酶在RNA/DNA杂合链的作用

 

2）SHERRY应用于一步快速RNA-seq文库制备

Tn5转座酶作用于RNA/DNA杂合链的转录组测序快速建库方法，作者起名为SHERRY（Sequencing HEteRo RNA-DNA-Hybrid），SHERRY法转录组快速建库流程：不同种类的RNA经过oligo-dT引物的反转录后，Tn5转座酶随机结合在RNA/DNA杂合链上进行切割；在Tagmentation之后，转座酶会在杂合链两端加上adaptor接头，随后进行延伸反应得到完整的含接头的双链DNA，最后在测序引物作用下进行之后的PCR文库扩增。

图2.SHERRY转录组测序技术路线

SHERRY法转录组快速建库流程和常规RNA-seq法在10 ng和200 ng的起始RNA上进一步验证，结果显示起始量为10 ng的RNA，SHERRY法检测结果更精确。在差异表达基因检测能力方面，SHERRY法和常规RNA-seq法检测差异基因数目和fold changes数较为一致。同时实验发现scSHERRY法在单细胞转录组测序中表现为更高的测序质量和更低的偏好性。

图3.SHERRY法在转录组测序的应用

 

文章亮点 

亮点1：Tn5转座酶识别RNA/DNA杂交双链并一步完成片段化和加接头反应，突n破了在双链DNA上应用的限制；

亮点2：基于SHERRY的RNA-seq整体包含三个流程：RNA逆转录、RNA/cDNA的片段化和PCR扩增，简化了常规RNA-Seq建库流程，总体耗时仅约4小时，手动操作时间少于30分钟，同时可在一个管子中完成反应。实现RNA的快速建库，也极大的保证了测序的真实性。

亮点3：测序成本方面，SHERRY法转录组建库仅为常规RNA-seq法的五分之一，大大节省实验成本。

 

总结

基于Tn5转座酶直接作用于RNA/DNA杂合链的片段化原理开发了一种转录组测序快速建库新方法-SHERRY，进一步拓展了Tn5转座酶的新用途，不仅解决了常规RNA-seq过程繁琐、耗时长和偏好性大的问题，同时成本方面也大大降低。因此，相较于传统的RNA文库制备方法，SHERRY法快速建库有着更大的竞争力。当前常规RNA-seq在SARS-CoV-2的鉴定、分型、溯源、诊断等方面展现了重要作用，但仍基于传统的病原微生物宏基因组测序方法，耗时长且过程繁琐。而基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法或将为快速、精准检测带来新的曙光。

 

参考文献：Lin Di, Yusi Fu, Yue Sun, Jie Li, Lu Liu, Jiacheng Yao, Guanbo Wang, Yalei Wu, Kaiqin Lao, Raymond W. Lee, Genhua Zheng, Jun Xu,  View ORCID ProfileJuntaek Oh,  View ORCID ProfileDong Wang, X. Sunney Xie, Yanyi Huang, and  View ORCID ProfileJianbin Wang，RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids（2020）. PNAS,117(6):2886-2893.

原文链接：https://www.pnas.org/content/pnas/117/6/2886.

 

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方案一产品：

试剂类别	产品名称	规格	货号
核糖体去除	Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)	8/24/96 T	12253ES08/24/96
	Hieff NGS® RNA Cleaner	5/60/450 mL	12602ES08/56/75
华大平台 RNA建库	Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for MGI®	8/16/96 T	13333ES08/24/96
Illumina平台 RNA建库	Hieff NGS® Dual-Mode RNA   Library Prep Kit for illumina®	8/16/96 T	12252ES08/24/96

 

方案二产品：

试剂类别	产品名称	规格	货号
逆转录酶	Hifair® IV Reverse   Transcriptase 第四代耐热逆转录酶	10000/5*10000 U	11112ES92/93
Tn5建库试剂盒	Hieff NGS® Fast Tagment   DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)	8/24/96 T	12206ES08/24/96
Tn5接头	Hieff NGS® Tagment Index   Kit for Illumina® (96 Index)	96 T	12610ES96