做二代测序建库，最怕什么？不是仪器贵，而是“连接失败”——就像辛辛苦苦炖了一锅番茄意面，结果面条和酱汁各过各的，毫无灵魂。今天，我们用厨房语言把翌圣OnePot Pro建库试剂盒（货号12972ES，Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4，酶切法建库试剂盒）的10个关键技术点，一次性讲清。看完你就能像米其林主厨一样，稳稳端出一碗“高分paper级”的NGS文库。

图1 .OnePot Pro DNA建库试剂盒操作流程

烂番茄再多也煮不出好汤。DNA的A260/280要在1.8–2.0，A260/230≥1.5；降解的DNA就像烂番茄，末端“坑坑洼洼”，接头根本挂不住。先用1%琼脂糖或Bioanalyzer看一眼“番茄弹性”，再下锅。

传统超声像手剁番茄，粗细随缘；OnePot Pro的Smearase^®酶切就是自动切丁机，30 ℃ 20 min切出200–400 bp的黄金丁。切太小成番茄酱（短片段），切太大煮不透（长片段），都会影响后面“挂汁”。

表1 .常规基因组DNA片段化条件选择参考表

以250ng 常规gDNA为模板，使用本酶切试剂盒进行片段化，片段化条件为30℃/35℃分别酶切10/15/ 20/25/30/40 min，片段化产物2.0x磁珠纯化，15 μL ddH₂O洗脱，Qubit测定浓度后，回收的插入片段分布如下图所示。

图2 .30℃不同片段化时间峰图

图3 .35℃不同片段化时间峰图

番茄焯水去生味，再撒盐提味。酶切后，试剂盒自带的“末端修复+dA-Tailing”一步完成，相当于给番茄块抹上一层“黏性盐”，让面条（接头）一碰就粘。

图4.末端修复与dA-Tailing示意图

说明书里的“接头稀释表”，就是意面酱包的兑水比例。1 ng DNA兑0.5 μM酱汁，100 ng兑5 μM。酱太稠——接头二聚体糊锅；酱太稀——面条没味道。接头一次解冻，分装冷冻，像分装番茄酱，避免反复冻融变味。

表2 .1ng~1 μg Input DNA针对Illumina^®测序平台推荐常规和UMI Adapter使用浓度

表3.1ng~1μg Input DNA针对MGI^®测序平台推荐常规和UMI Adapter使用浓度

Ligation Enhancer像一勺“高汤淀粉”，增加酱汁黏度；体系太小，面条打结；体系≥100 μL，面条在锅里自由翻滚。20 ℃精准控温，热盖关掉——相当于小火慢炖，不让酱汁沸腾焦底。

表4.Adapter Ligation PCR体系

【注】：

*Ligation Enhancer比较粘稠，使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致，Illumina^®平台皆为15 μM，MGI®平台皆为10 μM；具体的接头使用量可以参照注意事项三表1-2，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

***PE Adapter为短接头中不含index序列的通用接头，不同的货号中通用接头的名称不同。若使用长接头，则PE Adapter直接替换成含Index的长接头。

15 min是标准“焖面时间”。时间短，酱汁没吸透；时间>45 min，锅底糊化（二聚体）。低起始量（≤10 ng）可延长到30 min，但记得设阴性对照，看糊锅程度。

表5.Adapter Ligation PCR反应程序

【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。

煮好的面过冷水，冲掉多余酱汁。0.8×磁珠=第一次过水，去掉游离接头；80%乙醇现配现用，像现开一桶矿泉水，防止旧水有异味（盐离子、乙醇残留）。冲太久面条硬（磁珠过度干燥），冲不净油腻（残留PEG）。

循环数=回锅收汁次数。1 ng DNA需12–14次，100 ng只需5–7次。次数多，汤浓但易糊（文库偏好性、嵌合体、扩增突变积累等）。用qPCR当“尝咸淡”，只扩两端都带酱汁的面条（可测序分子）。

表6.1 ng~1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

【注】如果使用了不完整的接头，需要扩增1~3个循环，形成完整的接头。建库过程中若进行片段分选，扩增时请参照较高循环数扩增。

厨房生熟分离，建库也要分区：DNA区、PCR区、产物区分开，每天漂白水擦台面，防串味（交叉污染）。带滤芯枪头就像一次性筷子，一夹一换。

qPCR绝对定量=主厨最后一勺试味。连接效率理想目标≥70%；低于30%就回炉：加酱（接头）或换番茄（重提DNA）。Bioanalyzer峰图要像一碗面条整齐排布，有一条漂亮主峰，窄而顶部圆润的独峰。

照着做，你的NGS“番茄意面”就能从实验室小锅端到Nature大餐桌！
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