产品简介
Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®是针对MGI高通量测序平台专门开发设计的单链环化试剂盒。本产品采用高质量的酶和经优化后的Buffer组成,显著提高反应效率,使整个环化消化流程在30 min内完成。本试剂盒适用于所有连接华大标准的双标签PCR接头文库扩增产物,除建库试剂本身的限制外,本环化试剂盒不限MGI测序平台。
组分信息
组分编号 |
组分名称 |
13340ES16 |
13340ES96 |
13340-A |
DB Splint Oligo |
96 μL |
576 μL |
13340-B |
Splint Buffer |
240 μL |
2×720 μL |
13340-C |
Ligase |
80 μL |
480 μL |
13340-D |
Digestion Buffer |
128 μL |
768 μL |
13340-E |
Digestion Enzyme |
32 μL |
192 μL |
储存条件
-25~-15℃保存,有效期1年。
注意事项
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。
7. 本产品仅作科研用途!
样本量要求
1. 本试剂盒推荐的Input DNA量为1 pmol;若文库产量不足,最低可降至0.5 pmol投入量。
2. 若有特殊的环化投入量需求,可按照需求投入,但原则上不宜超过2 pmol。
3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子对应不同的质量,可根据公式 1 计算或参考表1选择所需的 Input DNA量:
公式 1 PCR 产物摩尔数与质量间的换算
1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表1 不同片段大小PCR产物1pmol对应产量
插入片段大小(bp) |
PCR产物主片段大小(bp) |
1 pmol对应产量(ng) |
150 |
300 |
198 |
200 |
350 |
231 |
250 |
400 |
264 |
300 |
450 |
297 |
样本混样要求
1. Input DNA可以是单个样本,也可以是多个带有不同Barcodes的样本的混合物。
2. 混合后的样本总量推荐为1 pmol,若每个样本所需数据量相同,则等量混合,每个样本所需的质量按照公式2进行计算:
公式 2 混合样本中单个样本所需质量的计算
单个样本所需的质量(ng)=1 pmol Input DNA对应的质量(ng)/混合的样本个数 N
3. 单个样本或混合后样本用于环化时,体积应为34 μL,若不足则用ddH2O补充至34 μL。
三、关于磁珠纯化
1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。
2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥约5 min。
5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。
四、关于文库质检
1. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链DNA荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。
2. 单链环产物纯化后产量应≥80 fmol(足够2次上机测序)。
3. 可根据公式3计算或参考表2。
公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
80 fmol单链环对应的质量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33
表2 不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量
插入片段大小(bp) |
PCR产物主片段大小(bp) |
80 fmol对应产量(ng) |
150 |
300 |
7.92 |
200 |
350 |
9.24 |
250 |
400 |
10.56 |
300 |
450 |
11.88 |
1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. 文库质控:Cat#12645,ssDNA Assay Kit或Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit。
3. 其他材料:80%乙醇、低吸附EP管、磁力架、PCR仪等。
图1 单链环化文库构建流程
变性
表3 DNA变性体系
名称 |
体积(μL) |
单个或混合好的双链文库 |
34 |
DB Splint Oligo |
6 |
Total |
40 |
【注】:部分PCR仪在程序结束后会迅速降温,不及时取出会导致DNA复性,环化效率降低。可将程序设置为【98℃,hold】,在文库放置到PCR仪上后,使用timer计时3min后将文库立即取出置于冰上。
单链环化
1. 将表4中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表4反应体系。
表4 单链环化体系
名称 |
体积(μL) |
上一步反应物 |
40 |
Splint Buffer |
15 |
Ligase |
5 |
Total |
60 |
4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表5所示设置反应程序,进行单链环化反应。
表5单链环化反应程序
温度 |
时间 |
热盖42°C |
on |
37°C |
15 min |
4°C |
Hold |
酶切消化
1. 将表6中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表6所示反应体系。
表6 酶切消化体系
名称 |
体积(μL) |
上一步反应物 |
60 |
Digestion buffer |
8 |
Digestion Enzyme |
2 |
Total |
70 |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表7的条件进行反应。
表7 酶切消化反应程序
温度 |
时间 |
热盖42°C |
on |
37°C |
10 min |
4°C |
Hold |
5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化。
消化产物纯化
该步骤使用磁珠对酶切消化的产物进行纯化。
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中,室温孵10min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min。
9. 短暂离心,将PCR管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新PCR管中。
★停止点:环化纯化产物,可置于-20℃储存一个月。
消化产物质控
使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对纯化产物进行定量,具体请参见注意事项四。
Ver.CN20250218