Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®

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产品说明书

FAQ

COA

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产品简介

 

Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®是针对MGI高通量测序平台专门开发设计的单链环化试剂盒。本产品采用高质量的酶和经优化后的Buffer组成,显著提高反应效率,使整个环化消化流程在30 min内完成。本试剂盒适用于所有连接华大标准的双标签PCR接头文库扩增产物,除建库试剂本身的限制外,本环化试剂盒不限MGI测序平台。

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

13340ES16

13340ES96

13340-A

DB Splint Oligo

96 μL

576 μL

13340-B

Splint Buffer

240 μL

2×720 μL

13340-C

Ligase

80 μL

480 μL

13340-D

Digestion Buffer

128 μL

768 μL

13340-E

Digestion Enzyme

32 μL

192 μL

 

储存条件

 

-25~-15℃保存,有效期1年。

 

注意事项

 

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途!

二、样本要求及处理

样本量要求

1. 本试剂盒推荐的Input DNA量为1 pmol;若文库产量不足,最低可降至0.5 pmol投入量。

2. 若有特殊的环化投入量需求,可按照需求投入,但原则上不宜超过2 pmol。

3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子对应不同的质量,可根据公式 1 计算或参考表1选择所需的 Input DNA量:

公式 1 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

1  不同片段大小PCR产物1pmol对应产量

插入片段大小(bp)

PCR产物主片段大小(bp)

1 pmol对应产量(ng)

150

300

198

200

350

231

250

400

264

300

450

297

样本混样要求

1. Input DNA可以是单个样本,也可以是多个带有不同Barcodes的样本的混合物。

2. 混合后的样本总量推荐为1 pmol,若每个样本所需数据量相同,则等量混合,每个样本所需的质量按照公式2进行计算:

公式 2 混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量(ng)=1 pmol Input DNA对应的质量(ng)/混合的样本个数 N

3. 单个样本或混合后样本用于环化时,体积应为34 μL,若不足则用ddH2O补充至34 μL。

三、关于磁珠纯化

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检

1. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链DNA荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
2. 单链环产物纯化后产量应≥80 fmol(足够2次上机测序)。
3. 可根据公式3计算或参考表2。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
80 fmol单链环对应的质量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33

2  不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量

插入片段大小(bp)

PCR产物主片段大小(bp)

80 fmol对应产量(ng)

150

300

7.92

200

350

9.24

250

400

10.56

300

450

11.88

 

使用说明

 

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Cat#12645,ssDNA Assay Kit或Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit。

3. 其他材料:80%乙醇、低吸附EP管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

1  单链环化文库构建流程

三、操作步骤

变性

  1. 根据文库长度,取1 pmol 至0.2 ml PCR管中,用TE Buffer补充至34 μL。 
  2. 将表3中试剂解冻后,颠倒混匀并置于冰上备用。
  3. 于冰上配制表3反应体系。

3  DNA变性体系

名称

体积(μL)

单个或混合好的双链文库

34

DB Splint Oligo

6

Total

40

  1. 混匀后,在PCR仪上进行98℃变性3 min,之后立即置于冰上,冰浴2 min 后瞬时离心。

【注】:部分PCR仪在程序结束后会迅速降温,不及时取出会导致DNA复性,环化效率降低。可将程序设置为【98℃,hold】,在文库放置到PCR仪上后,使用timer计时3min后将文库立即取出置于冰上。

单链环化

1. 将表4中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表4反应体系。

4  单链环化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

40

Splint Buffer

15

Ligase

5

Total

60

  1. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表5所示设置反应程序,进行单链环化反应。

5单链环化反应程序

温度

时间

热盖42°C

on

37°C

15 min

4°C

Hold

酶切消化

1. 将表6中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表6所示反应体系。

6  酶切消化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

60

Digestion buffer

8

Digestion Enzyme

2

Total

70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表7的条件进行反应。

7  酶切消化反应程序

温度

时间

热盖42°C

on

37°C

10 min

4°C

Hold

5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化。

消化产物纯化

该步骤使用磁珠对酶切消化的产物进行纯化。

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中,室温孵10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min。

9. 短暂离心,将PCR管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新PCR管中。

★停止点:环化纯化产物,可置于-20℃储存一个月。

消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对纯化产物进行定量,具体请参见注意事项四。

 

 

Ver.CN20250218

 

400-6111-883