Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®是针对 MGI^®高通量测序平台专门开发设计的单链环化试剂盒。本产品采用高质量的酶和经优化后的 buffer 组成，显著提高反应效率，使整个环化消化流程在 30 min 内完成。本试剂盒适用于所有连接华大标准接头的文库扩增产物， 除建库试剂本身的限制外，本环化试剂盒不限 MGI^®测序平台。

 

产品组分

组分编号			组分名称	产品编号/规格
				13341ES08	13341ES16	13341ES96
13341-A			Splint Oligo	48 μL	96 μL	576 μL
13341-B			Splint Buffer	120 μL	240 μL	2×720 μL
13341-C			Ligase	40 μL	80 μL	480 μL
13341-D			Digestion Buffer	64 μL	128 μL	768 μL
13341-E			Digestion Enzyme	16 μL	32 μL	192 μL

 

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、样本要求及处理

2.1样本量要求

1. 本试剂盒推荐的Input DNA量为1 pmol；若PCR产物不足，最低可降至0.5 pmol投入量。

2. 若有特殊的环化投入量需求，则按照文库制备试剂盒的要求投入所需的 Input DNA 量。

3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子对应不同的质量，可根据公式 1 计算或参考表1选择所需的 Input DNA量：

公式 1 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表1  不同片段大小PCR产物1pmol对应产量

插入片段大小（bp）	PCR产物主片段大小（bp）	1 pmol对应产量（ng）
150	230	152
200	280	185
250	330	218
300	380	251

2.2 样本混样要求

1. Input DNA可以是单个样本，也可以是多个带有不同Barcodes的样本的混合物。

2. 对样本进行混合时需满足Barcodes混合的要求，可参考表Adapters试剂盒说明书选择合适的Barcodes进行混合。

3. 混合的样本总量推荐为1 pmol，若每个样本所需数据量相同，则等量混合，每个样本所需的质量按照公式2进行计算：

公式 2 混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量(ng)=1 pmol Input DNA对应的质量（ng）/混合的样本个数 N

4. 单个样本或混合后样本用于环化时，体积应为34 μL，若不足则用 ddH₂O补充至34 μL。

三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit^® ssDNA Assay Kit 单链DNA荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  

2. 针对华大智造高通量测序平台， 单链环产物纯化后产量应≥80 fmol（足够2次上机测序）。

3. 可根据公式3计算或参考表2。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算

80 fmol单链环对应的质量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33

表2  不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量

插入片段大小（bp）	PCR产物主片段大小（bp）	80 fmol对应产量（ng）
150	230	6.07
200	280	7.39
250	330	8.71
300	380	10.03

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit^® ssDNA Assay Kit。

3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

 

图1  单链环化文库构建流程

三、操作步骤

3.1 变性

1. 根据文库长度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用ddH₂O补充至34 μL。

2. 将表3中试剂解冻后，颠倒混匀并置于冰上备用。

3. 于冰上配制表3反应体系。

表3  DNA变性体系

名称	体积（μL）
单个或混合好的双链文库	34
Splint Oligo	6
Total	40

4. 混匀后，在PCR仪上进行98℃变性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min 后瞬时离心。

3.2 单链环化

1. 将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表4反应体系。

表4  单链环化体系

名称	体积（μL）
上一步反应物	40
Splint Buffer	15
Ligase	5
Total	60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表5所示设置反应程序，进行单链环化反应。

表5单链环化反应程序

温度	时间
热盖105°C	OFF
37°C	15min
4°C	Hold

3.3 酶切消化

1. 将表6中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表6所示反应体系。

表6  酶切消化体系

名称	体积（μL）
上一步反应物	60
Digestion Buffer	8
Digestion Enzyme	2
Total	70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表7的条件进行反应：

表7  酶切消化反应程序

温度	时间
热盖105°C	OFF
37°C	10 min
4°C	Hold

5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。

3.4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads至消化产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。

9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中。

★停止点：环化纯化产物，可置于-20℃储存一个月。

3.4 消化产物质控

使用Qubit^® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。

 

HB220426