干货 | DNA Marker怎么选？

当做完质粒酶切处理后，需要进行电泳割胶回收，片段大小分别1500bp和5500 bp，以下DNA Marker，选用哪一个是最合适的呢？

DNA Marker的片段范围是否合适？

选择的Marker其对应的片段范围需要包含对应的目的DNA片段，且尽量处于中间，而不是在两端。在这个情况下，A和B就排除了，其最大条带都已小于5500bp。

目标片段大小附近条带是否密集？是否有助于判断条带大小？

PCR扩增时不排除会出现非特异扩增，出现大小相对接近的非特异条带。酶切时，也可能发生污染或星号活性，从而产生其他片段。选用目的片段附近密集且助于判断大小的DNA Marker有助于我们分辨非特异条带。此时D就排除，选用C。

是否含有突出指示带，便于电泳时快速定位？

在实际电泳的时候，如果有两个以上的DNA Marker都满足1和2的条件时，选用哪一个呢？有小伙伴会表示，都用在一块胶上，进行交叉分析。这样当然可行。那如果只能用一个的话，尽量选择含有明显突出指示带且指示带较为接近目的条带的，更准更稳进行定位。

核酸电泳实验中，除选择正确合适的DNA Marker外，其他的因素也需要关注。

电泳液的选择和使用

电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和电泳过程，其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液。

缓冲液	TAE	TBE
产品优势	u 可更好地分离大片段 u 缓冲能力低；更适用于短时间运行 u 适合于下游的酶学应用	u 适用于短片段(线性dsDNA在TBE中迁移慢10%) u 离子强度高、缓冲能力强；适用于长时间运行 u 不易导致过热
缺点	u 更容易导致过热，导致样品变性或扩散	u 抑制酶，不适合下游酶学步骤(如酶切、克隆和PCR等)
DNA分辨率	＞1000bp	＜5000bp
RNA分辨率	＞1500bp	＜1500bp

在实验时，同时要注意，凝胶应完全浸没在缓冲液中，以防凝胶干燥。但是凝胶上方的缓冲液深度不要太高，过高会导致核酸迁移性降低，易导致条带扭曲和过热，同时当同一份缓冲液使用多次后，其本身的缓冲能力会变差，从而导致条带不平整。

凝胶的选择和使用

琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。

	琼脂糖凝胶	聚丙烯酰胺凝胶
原料来源	来源于海藻的多糖聚合物	丙烯酰胺交联，甲叉双丙烯酰胺
制胶方法	融化和凝固	化学反应
核酸回收	融化&提取	溶解&扩散
核酸分离范围	50bp-50000 bp	5bp-3000 bp
分辨率	5-10个核苷酸	单个核苷酸

核酸染料的选择和使用

染料的选择和实验结果的清晰度及实验人员的安全息息相关。

染料类型	YeaRed	YeaGreen	EB	Goldview
激发波长	304 nm	260nm或471nm	302 nm	254nm和501nm
安全性	√√√	√√√	×××××	×××
适用凝胶	琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶
适用仪器	紫外成像仪	紫外成像仪或蓝光成像仪	紫外成像仪	紫外成像仪或蓝光成像仪
适用范围	染色后产物兼容胶回收，克隆和测序等下游实验。			不适合进行胶回收实验。

产品特别推荐

GoldBand Full-Scale DNA Ladder

由12,000 bp、8,000 bp、6,000 bp、5,000 bp、4,000 bp、3,000 bp、2,500 bp、2,000 bp、1,500 bp、1,200 bp、1,000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300bp、200 bp以及100 bp共20条线状双链DNA片段组成。

1支应用范围抵得上3支不同范围的DNA Marker。

>覆盖片段范围广：100bp-12000bp；

>条带密集：涉及20个条带；

>指示明确：含3个指示带，各条带浓度已知，便于定位及半定量分析；

>背景干净、带型稳定、大小精准。

DNA MarKer 使用相关FAQ

Marker条带模糊、拖尾、扩散

DNA降解

排查方向：Marker是否反复冻融？是否长时间置于室温或4°C？储存管是否污染了核酸酶？
解决方案：将Marker小剂量分装，避免反复冻融；使用后立即放回-20°C；确保使用无菌的枪头和离心管。

凝胶问题

排查方向：琼脂糖是否完全溶解？凝胶是否有气泡或凝固不均匀？缓冲液是否陈旧或重复使用次数过多？
解决方案： 加热溶解琼脂糖后务必摇匀；倒入胶板前静置片刻让气泡逸出；使用新鲜配制的电泳缓冲液（TAE或TBE）。

电泳条件不当

排查方向：电压是否过高？
解决方案：适当降低电泳电压（如从10 V/cm降至5-8 V/cm）。电压过高会导致产热，使DNA条带呈“微笑”状并模糊。

上样量过大

排查方向：是否超过了说明书推荐的上样量？
解决方案：减少上样量。过多的DNA会超出凝胶的分离能力，导致条带过宽、拖尾。

核酸染料问题

排查方向：染料是否失效？凝胶中染料浓度是否均匀？

解决方案：使用新鲜配制的染料，或确保染料已与凝胶/缓冲液充分混匀。

Marker条带缺失、条带数量不对或强度异常弱

部分降解

排查方向：特别是大片段条带缺失，很可能是物理剪切或核酸酶污染导致的大片段降解。
解决方案：使用新分装的Marker，操作轻柔。

上样错误

排查方向：是否忘记加Marker？点样时是否戳破了加样孔导致泄漏？枪头内是否有样品？
解决方案：养成良好习惯，先加Marker，再加样品；点样时手要稳，枪头尖端轻轻伸入加样孔即可。

上样错误

排查方向：紫外光照射时间是否过长导致DNA淬灭？成像系统灵敏度或曝光时间设置是否正确？
解决方案：缩短紫外灯下的观察时间；调整成像系统的曝光时间或光圈。

Marker条带扭曲、不整齐

解决方案： 加热溶解琼脂糖后务必摇匀；倒入胶板前静置片刻让气泡逸出；使用新鲜配制的电泳缓冲液（TAE或TBE）。

电泳过热

排查方向：电压是否太高？电泳槽是否放在冰上或连接了冷却系统？
解决方案：降低电压；在冷室进行电泳或使用循环水冷却装置。

凝胶凝固不均匀或存在缺陷

排查方向：凝胶表面是否平整？
解决方案：确保胶板水平，倒入融化的琼脂糖后让其自然凝固，避免震动。

未知DNA片段的大小与Marker比对后，和预期不符

凝胶浓度与电泳条件不匹配

排查方向：不同浓度的凝胶对DNA的分离范围不同。在高浓度凝胶中，小片段分离好，大片段迁移慢；低浓度则相反。
解决方案：根据目标片段大小选择合适的凝胶浓度，并确保在相同的条件下比较Marker和样品。

缓冲系统影响

排查方向：使用的是TAE还是TBE缓冲液？
解决方案：TBE的缓冲能力比TAE强，对于分离小片段（<1 kb）效果更好，且DNA在TAE中的迁移速率比在TBE中快约10%。比较大小时应在同一缓冲系统中进行。

核酸染料的影响

排查方向：使用的是哪种染料？
解决方案：某些高灵敏度染料（如GelRed, SYBR Green）会与DNA结合，使其迁移速率略微变慢，导致表观分子量比实际偏大。这通常是系统误差，只要每次条件一致，不影响比对。

DNA构象影响

排查方向：你的样品是线性DNA吗？
解决方案：超螺旋、开环质粒DNA的迁移速率与线性DNA完全不同，不能直接用线性DNA Marker来比对大小。如需比对，应先将质粒酶切成线性。

利用Marker估算的样品浓度不准

条带亮度比较不准确

排查方向：是否选择了浓度相近的条带进行比较？不同片段长度的DNA与染料结合效率可能有细微差异。
解决方案：尽量选择与目标条带大小相近的Marker条带进行亮度比较。这只是半定量方法，对于精确定量，应使用分光光度计或荧光计（如Qubit）。

上样体积不一致

排查方向：Marker和样品的上样体积是否严格相同？
解决方案：确保使用同一把移液器，并且上样体积一致。

成像系统非线性

排查方向：图像是否过曝？饱和的条带无法用于定量。
解决方案：使用凝胶成像系统的线性拍摄模式，并确保所有条带都在检测的线性范围内，避免过曝或过暗。

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