Q：如何评判qPCR实验结果的有效性？

A：主要看以下两个指标。

1）Ct值：阳性：15＜Ct＜30，阴性对照：Ct＞35。

2）融解曲线：单一峰。

Q：为什么Ct值偏大（CT值≥30）。

A：可能有以下原因。

1）模板量低：减少稀释倍数或增加模板量，使Ct值尽量落在15－30之间。

2）扩增效率低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序或重新设计引物。

3）PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内，不建议超过300bp。

4）体系中存在抑制剂：加大模板稀释倍数或重新制备模板重复实验。

Q：为什么扩增曲线不稳定，平台期出现锯齿状？

A：可能有以下原因。

1）RNA纯度低：稀释模板或换用高纯度RNA。

2）仪器长时间未做校准：定期（一般1年）进行仪器校准保养。

Q：为什么扩增曲线无法达到平台期？

A：可能有以下原因。

1）模板量太低：提高模板量。

2）循环次数太少：提高循环次数。

3）试剂扩增效率低：做标准曲线测定试剂的扩增效率。

Q：为什么扩增曲线平台期荧光值下降？

A：可能有以下原因。

1）模板不纯：提高体系纯度或稀释模板。

2）模板量过高：降低模板量。

Q：为什么有融解曲线，无扩增曲线？

A：未在延伸阶段收集荧光信号：重新实验收集荧光信号。两步法扩增程序一般在退火延伸阶段收集，而三步法扩增程序在延伸阶段收集。

Q：为什么阴性对照有扩增？

A：可能有以下原因。

1）反应体系被污染：逐一做对比实验，排除污染源。

2）引物二聚体：若融解曲线Tm值＜80℃，阴性对照CT＞35，属正常情况。

Q：为什么融解曲线出现双峰？

A：可能有以下原因。

1）若较低峰Tm在80℃之前，则可能存在引物二聚体：可通过提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式调整实验。

2）若双峰Tm都在80℃以后，则可能：①引物特异性过差：Blast检查引物特异性，重新设计引物。②有gDNA污染：重新制备模板。                                         

Q：为什么融解曲线是单峰，但峰不尖锐？

A：存在大小相近的非特异性扩增：进行高分辨率琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

Q：为什么有扩增曲线，无融解曲线？

A：融解曲线未选择收集荧光信号：重新实验，在仪器正确的位置处收集荧光信号，大多仪器是选择照相机按钮。Roche仪器需在融解曲线设置最后一步95℃处的acquisition MODE为continues。

Q：为什么融解曲线初期时峰就很高？

A：ROX添加不当：可通过设置NO ROX模式后看曲线是否正常，若正常表示ROX添加错误，可调整ROX的含量。

Q：为什么融解曲线峰型杂乱？

A：可能有以下原因。

1）反应体系污染：在无模板洁净区内配制体系，做好阳性、阴性对照。

2）试剂失效：避免将试剂暴露在强光或高温下。

3）仪器长时间未做校准：定期（一般1年）进行仪器校准保养。

4）耗材与仪器不匹配：选用与仪器匹配的耗材。

Q：为什么技术性重复性差？

A：可能有以下原因。

1）加样误差：模板稀释，提高加样体积。扩大反应体系。使用精准移液枪。

2）模板量低：提高模板量。

3）仪器长时间未做校准：定期（一般1年）进行仪器校准保养。