内参即内部参照(Internal Control),类似于荧光定量实验的内参基因,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由看家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在不同组织和细胞中的表达相对恒定,常用它作为检测目的蛋白表达水平变化时来做参照物。
1. 内参抗体的功能:
(1)检测整个WB流程是否正常
(2)检测基因表达产物是否正确
(3)比较表达产物微量的相对变化
(4)评价各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致
2. 内参抗体的选择:
(1) 样本种属来源
l 哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、NaK、Atpase等。
l 植物来源实验样本,则可以选择plant actin、Rubisco等。
l 根据来源样本选择不同的内参,是WB实验成功的关键。也可参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。
(2)目的蛋白分子量
选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 KD以上。比如目的蛋白分子量为45 KD,此时不适宜选择β-actin(43 KD)作为内参,可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。