Hieff NGS^® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit V2 是针对 Illumina^®高通量测序平台专业开发设计的新一代 PCR Free 版建库试剂盒。本产品采用高质量的酶学组成，在前一代PCR Free 版建库试剂盒的基础上，改进了DNA片段末端修复和加A效率，同时改善了接头连接效率。可应用于常规动植物基因组、微生物基因组、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等样本，助力获得优异的测序数据。

产品组分

组分编号		组分名称	产品编号/规格
			12196ES08	12196ES24	12196ES96
12196-A		Endprep Buffer 2.0	48 μL	144 μL	576 μL
12196-B		Endprep Enzyme 2.0	32 μL	96 μL	384 μL
12196-C		Ligation Enhancer 2.0	240 μL	720 μL	3×960 μL
12196-D		Rapid T4 DNA Ligase 2.0	40 μL	120 μL	480 μL

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20 °C保存，有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒中兼容机械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本试剂盒兼容范围为5ng - 1000 ng Input DNA。应尽可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高质量Input DNA。表1中列举了将本试剂盒应用于常见应用中推荐的Input DNA量。

表1  常见应用中推荐Input DNA量

应用	样本类型	推荐Input DNA量
全基因组测序	复杂基因组	50 ng-1000 ng
靶向捕获测序	复杂基因组	10 ng-1000 ng
全基因组测序，靶向捕获测序	FFPE DNA	50 ng-1000 ng
全基因组测序，靶向捕获测序	cfDNA/ctDNA	≥5 ng
全基因组测序	微生物基因组	≥5 ng
全基因组测序PCR-free测序	高质量DNA	≥50 ng

【注】：上表为使用高质量DNA时推荐的Input DNA量，当Input DNA质量较差或需要进行片段分选时，应适当上调使用量。

3. Input DNA特指投入末端修复/dA尾添加步骤中的DNA。

4. Input DNA制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响末端修复/dA尾添加步骤反应效率，建议DNA片段化后进行磁珠纯化或分选。当使用机械法进行DNA片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化，请勿在灭菌超纯水中进行。

三、关于接头连接（Adapter Ligation)

1. 针对Illumina^®测序平台，Yeasen提供了Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®，Set 1~Set 2 （Cat#13519-Cat#13520），试剂盒中的接头浓度为15 μM。

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量；使用Adapter时根据Input DNA量用TE Buffer进行相应稀释。表2列举了使用本试剂盒的不同Input DNA量推荐的Complete Adapter for Illumina^®稀释方法。

表2  5 ng-1000 ng Input DNA推荐的Complete Adapter for Illumina^®使用浓度

Input DNA	Adapter稀释倍数	浓度
5 ng ~ 10 ng	75倍稀释	0.2 μM
10 ng ~25 ng	15倍稀释	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀释	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀释	5 μM

四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，不建议分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1个月。

五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：根据需要可选择Yeasen 官网售卖的Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®， Set 1~Set 2 （Cat#13519-Cat#13520）DNA 文库构建专用配套试剂盒，接头详细介绍信息参考上面注意事项中的第三部分“关于接头连接”。

4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer （10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

图1  Hieff NGS^® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit ^® V2操作流程

三、操作步骤

3.1 末端修复/dA尾添加（End Repair/dA-Taling）

该步骤将片段化后的Input DNA末端补平，并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表3所示反应体系。

表3  末端修复/dA尾添加PCR反应体系

名称	体积 (μL)
Fragmented DNA	x
Endprep Buffer 2.0	6
Endprep Enzyme 2.0	4
ddH2O	Up to 60

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行末端修复/dA尾添加反应。

表4  末端修复/dA尾添加PCR反应程序

温度	时间
热盖105 °C	On
30 °C	20 min
72 °C	20 min
4 °C	Hold

3.2 接头连接 (Adapter Ligation)

该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的Illumina^®接头。

1. 根据Input DNA量按表2稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表5中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表5所示反应体系。

表5  Adapter Ligation PCR体系

名称	体积 (μL)
dA-tailed DNA（3.1步骤产物）	60
Ligation Enhancer 2.0	30*
DNA Adapter	5**
Rapid T4 DNA Ligase 2.0	5

【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时后离心使用。

**本公司针对Illumina^®测序平台的接头浓度为15 μM。请根据注意事项三中的提示，对接头进行稀释，加水补齐，使接头体积为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表6所示反应程序，进行接头连接反应：

表6  Adapter Ligation PCR反应程序

温度	时间
热盖	Off
20 °C	15 min
4 °C	Hold

【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。

3.3 连接产物磁珠纯化（Post-Ligation Clean Up）

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行直接纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。直接纯化步骤参考3.3.1，分选步骤参考3.3.2。

3.3.1 纯化操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：

1)如产物无需进行片段分选，直接加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。

【注】：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱。

2)如产物需进行双轮分选，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。

【注】：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱。

3.3.2 双轮分选操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

3. 根据DNA片段长度要求，参考表7向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。

表7  磁珠文库分选推荐比例

DNA文库大小（插入片段）	150 - 250 bp	200-300 bp	300-400 bp	400-500 bp
DNA文库大小	250-350 bp	350-450 bp	450-550 bp	550-650 bp
第一轮体积比（Beads:DNA）	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×
第二轮体积比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×

【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL；表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用户在接头连接前进行分选，请采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads （Cat#12601）说明书中推荐的比例。

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重复步骤9。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量11 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移10 μL上清至干净的管中。

3.4 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

HB220928