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NGS文库构建-关键酶竟然是这些？

高通量测序又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing, NGS)，相对于第一代DNA测序技术（Sanger法），它可以同时对几十万乃至数百万条核酸分子序列进行测定，具有通量高、成本低、规模大等显著优势，应用范围非常广泛，目前已经成为全球主流测序技术。

 
NGS测序流程主要分为样本制备、文库构建、上机测序、数据分析四个流程，在上述涉及的相关实验过程中，酶在其中起着至关重要的作用，这里针对性的对文库构建中的关键酶进行介绍。
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图1. NGS测序流程图(Gulilat, M. et al. 2019, BMC Medical Genomics)
 
文库构建的本质是将片段化后的基因组DNA两端加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的文库核酸分子。根据样本类型，又分为DNA建库和RNA建库。在DNA文库构建过程中，TA克隆连接接头建库是目前商业技术中最常用的技术手段，主要建库流程如下：
 
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图2. Illumina 平台DNA文库构建流程
 

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DNA片段化

 
由于目前市场中测序仪的测序长度通常在150-500bp之间，因此需要使用机械打断或酶切打断的方法将大片段基因组DNA片段化为小片段的DNA。机械打断的方式对样本的损耗相对较高，操作方式也更为复杂，市面上也常用酶切的方式对基因组DNA进行打断。与机械法相比，酶切法的成本更低，操作更简便，加入片段化酶后仅需反应一段时间即可。
 
目前常用的片段化酶主要有两种，一种是基于转座子原理的Tn5转座酶，另一种是核酸内切酶的混合酶，但是这些片段化酶的效果容易被样本GC含量、碱基偏好性所影响。与此相比，翌圣研发的片段化酶(Yeasen Cat#12917)酶切效果稳定，偏好性远低于Tn5转座酶，针对不同的DNA类型样本（包括FFPE样本）都有优异的测序结果。
 

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末端修复，3'端加“A”：

 
打断后的DNA会产生5'/3'黏性末端以及平末端，而所有的黏性末端都需要转为平末端，包括3'突出末端切平、5'突出末端补平。在使用TA连接的方式进行接头连接时，DNA片段还需要5'端磷酸化和在3'端加“A”，才能与带“T”黏性末端的接头互补配对。以上过程由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶协作完成。
 
T4 DNA聚合酶(Yeasen Cat#12901)具有5'→3'DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA，补平5'突出末端；同时该酶也具有3'→5'外切酶活性，能够用于3'突出末端的切平，从而将含黏性末端的DNA片段转变为平末端DNA。
 
由于人工合成的PCR引物、接头等5'端通常都是羟基基团而不是磷酸基团，因此需要T4多聚核苷酸激酶(Yeasen Cat#12902)在ATP 存在时催化ATP的γ-磷酸基团转移到寡核苷酸链的5'端羟基末端上，为下一步连接接头做准备。
 
Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有5'→3'聚合酶活性，可以从5'→3'方向合成DNA，同时它具有的脱氧核苷酸转移酶活性可以在PCR产物的3'末端添加一个核苷酸“A”。
 
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图3. 多种酶参与末端修复过程
 

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接头连接：

 
接头是文库中的重要组成部分，测序中常用的Illumina平台Y型接头，包含P5/P7、Index、以及Rd1/Rd2 SP序列。其中，P5/P7序列用于和测序芯片上的序列进行配对，将待测片段固定在Flowcell上完成桥式扩增；Index用来区分上机测序混合文库中的不同样本，而Rd1/Rd2 SP是Read1和Read2测序引物结合区域。接头连接一般用T4 DNA连接酶(Yeasen Cat#10298)，它可以修复双链DNA上的单链切口，使两个相邻的核苷酸重新连接起来，在接头连接中可将带有“T”黏性末端的接头和带“A”黏性末端的DNA片段连接起来形成一个完整的双链。
 
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图4. Illumina 平台一般接头连接过程
 

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PCR富集：

 
通过PCR反应获取到足够多带接头的DNA序列，上机完成对样本核酸序列的测序。PCR通常用的Canace 高保真DNA聚合酶(Yeasen Cat#13476)具有5'→3'聚合酶结活性，可沿 5'→3'方向合成 DNA；除此之外，还具有3'→5'外切酶的活性，能够在扩增过程中纠正错误掺入的碱基，从而快速、高保真的扩增DNA片段。
 
RNA文库的构建，根据RNA的种类可以分为mRNA文库、LncRNA文库等，其中常规RNA文库构建包括以下过程：
 
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图5. Illumina平台mRNA文库构建
 

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RNA富集：

不论真核生物还是原核生物，其RNA中最多的是rRNA，其占比高达80%。如果直接对样本的总RNA进行测序，测序数据中绝大部分将为rRNA的相关数据，因此必须通过RNA富集的方法去除rRNA的干扰。RNA富集的方法有基于oligo-dT富集的mRNA方法和rRNA去除法。
 
真核生物mRNA在3'端具有明显的poly(A)的结构特点，利用Oligo(dT)磁珠可以富集样本转录出来的所有mRNA，从而进行转录本的分析，适用于高质量的RNA样本。而rRNA去除的方法对样本质量的要求要低于mRNA测序，同时适用于低质量(如FFPE样本)和高质量RNA样本，也适用于原核生物类型样本，商业常用RNase H消化的方法去除rRNA。具体步骤如下：

首先，合成能够与rRNA结合的特异性寡核苷酸探针；

 

其次，使用能够降解RNA-DNA杂合链中RNA 的RNase H(Yeasen Cat#12906)去除和探针结合的rRNA；

 

最后，使用可以消化单链或双链的DNA 的DNase I(Yeasen Cat#10325)消化掉DNA探针，从而最终达到去除rRNA的目的。

 
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图6. 基于酶法的rRNA去除原理示意图
 

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RNA片段化：

通常在二价阳离子以及高温的作用下，将大片段的RNA打断为小片段。
 

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cDNA一链合成：

将获取的目的RNA反转录成cDNA第一条链。因为RNA极易被环境中存在的RNase降解，在反转录过程中使用RNase Inhibitor(Yeasen Cat#10603)可以抑制这些酶的活性，保护RNA不被RNase降解。与此同时，使用逆转录酶(Yeasen Cat#11112)将模板RNA反转录成cDNA；逆转录酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，能够以RNA为模板，按5'→3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，也就是cDNA第一链。
 

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cDNA二链合成：

反转录合成的单链cDNA极不稳定，需立即在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二链。在二链合成时，RNase H可以除去RNA-DNA杂合链中的RNA链，配合DNA聚合酶Ⅰ (Yeasen Cat#12903)催化合成cDNA第二链。DNA聚合酶Ⅰ 具有5'→3' DNA聚合酶活性，可在模板和引物的作用下，沿5′→3′方向合成与cDNA一链互补的序列。
 
后续流程分别为末端修复、3'端加“A”、接头连接、PCR富集，这些在DNA文库构建中已有列举，这里不再多做赘述。需要注意的是，当反转录完成以后，不需要再次打断核酸片段。
 
翌圣生产多种NGS建库相关的酶，您可以使用下表，选择最适合的文库构建产品。
 
表1. 翌圣NGS常规DNA&RNA建库相关核心酶 选择指南
建库类别
定位
产品名称
产品货号
RNA建库
rRNA去除/cDNA二链合成

RNase H
12906
rRNA去除

Recombinant DNase I
10325
cDNA一链合成

Murine RNase Inhibitor
10603

Hifair® IV Reverse Transcriptase
11112
cDNA二链合成

DNA Polymerase I
12903
RNA建库&DNA建库
末端修复

T4 DNA Polymerase
12901

T4 Polynucleotide Kinase
12902
A尾添加

Taq DNA Polymerase
13486
接头连接

Hieff® Novel T4 DNA Ligase
10298
PCR富集

Hieff Canace®  Pro High-Fidelity DNA Polymerase
13476
DNA建库
DNA片段化

Hieff® Smearase Pro
12917
 
 
参考文献
 
 

1. Mardis, Elaine R. Next-Generation Sequencing Platforms[J]. Annual Review of Analytical Chemistry, 2013, 6(1):287-303.

 

2. Gulilat M, Lamb T, Teft W A, et al. Targeted next generation sequencing as a tool for recision medicine[J]. BMC Medical Genomics, 2019, 12.

 

3. Lundberg K S, Dan D S, Adams M, et al. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus.[J]. Gene, 1991, 108(1):1.

 

4. Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling[J]. Nucleic Acids Research, 2002, 30(24):e139.

 

5. 袁婺洲.《基因工程（第二版）》:化学工业出版社，2019

 

 

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