GUIDE
导 读
巨噬细胞的清除，是全面了解巨噬细胞在病理条件下功能的一种十分有力的研究方法，氯膦酸盐脂质体（Clodronate Liposomes）是目前最为成熟，方便，经济的一种巨噬细胞清除工具，可以有效的清除动物体内不同组织部位和血液中的巨噬细胞。
氯膦酸盐脂质体组成及原理
氯膦酸二钠（Clodronate）是一种双膦酸盐药物，在临床上主要用于癌症引起的溶骨性骨转移、骨质疏松症和高钙血症。其作用机理是氯膦酸二钠在细胞内代谢成不可水解的ATP类似物，抑制线粒体中的ADP/ATP转运机制，从而阻断线粒体呼吸链诱导细胞凋亡。但是该药物亲脂性低，不能跨细胞转运，在口服或是静脉给予游离药物后，2小时后即可达半衰期，48小时内80%药物随尿液排出。
脂质体是单层或多层脂质双分子层的球形囊泡，其主要成分是磷脂和胆固醇。脂质体本身具有双分子层结构，组成成分无毒性，因此可以作为运输分子物质的载体，它通过与细胞膜结合的方式将分子物质运输到细胞内。
图1：氯膦酸-脂质体（Clodronate liposomes）复合物
氯膦酸盐包裹进磷脂体的水相中形成氯膦酸盐脂质体，氯膦酸盐不能自由的通过脂质体磷脂体双分子层。注射到生物体内后，氯膦酸盐脂质体会被巨噬细胞吞噬，在巨噬细胞内的溶酶体磷酸酶的作用下，溶解在脂质体内的氯膦酸盐会被逐步释放出来并在细胞内积累，当达到一定浓度时，巨噬细胞将会受到不可逆损伤，诱发细胞凋亡。死亡细胞内的氯膦酸盐会被释放到细胞外，随尿液排出体外。
图2：巨噬细胞清除剂原理示意图
产品性质
1 mL脂质体体悬液中所含的氯膦酸大约为5 mg，脂质体直径为1.5-2μm。所用的磷酸盐缓冲液为10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，140 mM NaCl。
使用要点
» 必须使用无菌操作从小瓶中取出产品，如果无菌性受损，请勿使用。
» 当静置超过几个小时后，脂质体可能会沉淀，在使用之前，为了确保脂质体悬浮液均匀，缓慢倒转小瓶数次，直到悬浮液均匀，不要剧烈摇晃或震动。
» 在注射氯膦酸脂质体后数小时内，动物免疫能力开始下降，注意动物健康状况，以防止与实验无关的感染。
» 如果研究使用免疫缺陷小鼠预计会有很高的死亡率。
» 静脉给药时，请将药物加热至室温（18 ℃），并去除注射器中的气泡，缓慢注射，如果动物表现出任何异常反应，请降低注射速度。
» 脂质体应保存在4 °C，切勿冷冻。
体内注射方案（仅供参考）
尾静脉注射方法：
» 将小鼠固定，拉出尾巴，小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉，2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面，3条静脉呈品字型分布，一般采用左右两侧的静脉；
» 将纱布浸泡于约70 ℃温水中，拿出后包裹尾巴，使尾部血管扩张并软化表皮角质；
» 尾部静脉注射时，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出约2 cm一段，使皮肤紧张，静脉更为充盈，右手持1 mL针头注射器，使针头与静脉平行(小于30°角)，从尾巴的下1/4处进针。开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，可正式注入药物。
» 如需连续尾静脉注射给药，注射部位应尽可能从尾端开始，按次序向尾根部移动，更换血管位置注射给药。拔出针头后，用棉球按住注射部位轻压1-2 min，止血。
【注】：以上操作方法和剂量使用仅供参考，不同的实验请自行设计实验方案或是参考相关文献。
效果展示
参考案例一 »
图3： 左图是正常小鼠肝脏免疫细胞中Kupffer细胞的比例，右图是注射Clodronate Liposomes 48小时后Kupffer细胞的比例，可以看到Kupffer细胞基本被清除[1]。
参考案例二 »
图4： 上图是小鼠LLC细胞肺癌成瘤实验中正常肿瘤组织中的巨噬细胞（红色荧光），下图是气管灌注Clodronate Liposomes肿瘤组织中的巨噬细胞（红色荧光），可以看出肿瘤中的巨噬细胞基本被清除[2]。
不同组织巨噬细胞清除的实验方法 »
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靶向器官/细胞 |
实验方法 |
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脾脏/红髓区巨噬细胞 |
单次给药：200 μL/小鼠（静脉注射或腹腔注射） 长期耗竭：第一次给药剂量200 μL/小鼠，之后每隔三天给药200 μL/小鼠 |
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肝脏/Kupffer细胞 |
单次给药：200 μL/小鼠（静脉注射或腹腔注射） 长期耗竭：第一次给药剂量200 μL/小鼠，之后每隔三天给药200 μL/小鼠 |
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肺/肺泡巨噬细胞 |
静脉注射（150-200 μL）联合气管或鼻内（50 μL）给药获得最佳效果 |
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淋巴结 |
注射（100-200 μL）/小鼠，具体给药方式可参考文献 |
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脑/小胶质细胞 |
脑室脑脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠 |
【注】：本剂量仅供参考，请根据实验需求使用或参考文献。
FAQ
Q1:收到Clodronate liposomes后该如何操作？
A:收到氯膦酸脂质体后，如果不能马上使用，需要放置在4 ℃冰箱。禁止冻存！使用时作为原液使用，不能进行稀释。脂质体很容易发生沉淀，建议使用之前轻轻混匀，另外4 ℃的氯膦酸脂质体不能马上使用，需要恢复到室温才能进行注射。
Q2:如何将脂质体从小瓶中转移出来？
A:从小瓶中转移脂质体的最佳方法是使用无菌针头注射器。这样小瓶中剩余的脂质体悬浮液就可以保持密封和清洁。您也可以使用带有无菌吸头的移液器进行转移，但最好在洁净的环境中进行，例如在BSC罩中。
Q3: Clodronate liposomes能否用于体外巨噬细胞清除？
A:产品可以用于体外巨噬细胞的清除，但是这种方法比较适合体内实验。主要是由于在体外培养过程中，从死亡细胞释放的氯膦酸或者是从脂质体中“渗漏”出来氯膦酸，会一直存在于培养基中，但是在体内，氯膦酸的半衰期很短，很快就会被肾脏清除。虽然游离的氯膦酸不会进入细胞也不会进入脂质体，但是一旦他们在培养基中积累就会慢慢地进入细胞中。
Q4:在静脉注射Clodronate liposomes后动物很快就死亡了，是什么原因？
A:一方面有可能是动物注射了不均一的脂质体悬液。建议在使用之前轻轻摇晃混匀。脂质体在体外一段时间后会发生沉降。如果在很长一段时间内需要一次注射多只动物，那么脂质体便会在注射器中发生沉淀，形成不均一悬液，这样一来，第一只注射的计量与最后一只注射的计量就会发生明显的变化。另外一方面有可能是脂质体刚从冰箱取出后，没有恢复到室温。
Q5:动物在注射Clodronate liposomes后几天就死亡了？
A：这个可能是受到细菌的污染，体内清除巨噬细胞后会增加例如病毒粒子，细菌或者酵母感染的几率。
Q6:静脉注射Clodronate liposomes后大鼠脾脏/肝脏中的ED1+细胞并没有完全消失？
A：大鼠中成熟的巨噬细胞呈现ED1和ED2双阳性，但是有一些没有吞噬功能的或者吞噬作用小的前体细胞也是ED1+，但是呈现ED2-。因此，所有ED2+的细胞都可以被完全清除，但是ED1+的细胞却只能被部分清除，清除的比率取决于前体/成熟巨噬细胞的比例。
Q7: Clodronate liposomes没有达到期望的效果？
A：氯膦酸脂质体都是大批量的生产，每批次都会对氯膦酸的浓度以及一些可能的污染物进行检测，确保无误后才会销售给客户。另外，脂质体容易收到极端温度的影响。正确的运输和储存方式是4~8 ℃，悬液既不能被冻存，也不能被加热超过30 ℃。自收到货物起，需要在3个月内使用完，不然有可能会影响使用的效果。
Q8:在静脉注射时，能不能增加注射的体积？
A：静脉注射时需要依据动物的体重，不能超过0.1 mL/10 mg，但是进行腹腔注射可以适当的增加注射的体积。皮下注射需要根据注射位点的容量进行决定。
Q9:使用脂质体应注意的一些事项？
A：通过具有饱和烃链的脂质制备而来的脂质体实际上非常坚固，但仍需要注意以下一些事项。
①不要与有机溶剂混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、乙醚等。
②不要添加表面活性剂，除非您必须要这样做以裂解脂质体。
③不要加热、接近或高于脂质主相转变温度，除非进行药物加载，这需要在相变温度以上进行孵育。
产品订购
| 产品名称 | 货号 | 规格 | 价格（元） | 促销价（元） |
| Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam）体内巨噬细胞清除剂 | 40337ES08 | 5 mL | 3152 | 2736 |
| 40337ES10 | 10 mL | 5132 | 4376 | |
| Control Liposomes（PBS）体内巨噬细胞清除剂空白脂质体对照 | 40338ES08 | 5 mL | 1652 | 1436 |
| 40338ES10 | 10 mL | 2252 | 1956 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit 苏木素伊红（H&E）染色试剂盒 | 60524ES60 | 2×100 mL | 358 | —— |
| Prussian Blue Iron Stain Kit普鲁士蓝染色试剂盒（铁染色） | 60533ES20/60 | 20 T/100 T | 388/1288 | —— |
参考文献
[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
