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导 读
DNA甲基化（DNA methylation）是一种重要的表观遗传学标记，是指在DNA甲基化转移酶（DNMT）催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。
DNA甲基化是表观遗传学的核心组成部分，在基因的表达调控、正常细胞功能维持、胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。因此，明确甲基化位点对解析生命过程、探索肿瘤的发生发展、开发新的抗肿瘤策略等方面具有重要的意义。
单碱基水平检测甲基化是研究表观遗传学的重要内容。检测DNA甲基化首先要进行碱基转换以区分甲基化与非甲基化位点，而基于重亚硫酸盐bisulfite的转化的BS-seq方法无疑是金标准。
Bisulfite转化问题多
目前，基于重亚硫酸盐bisulfite的转化方法是在单碱基水平进行甲基化检测的金标准。其利用bisulfite将DNA上未发生甲基化的C转变成U，通过PCR扩增后测序鉴定甲基化位点。该方法C-U转化效率高达99%，但是，bisulfite转化方法存在致命的缺陷，主要包括以下几点：
1 对于核酸的损伤极高（图1），导致后续的文库制备通常只能选择以单链建库为主的文库制备方案，在珍稀样品（如cfDNA）中应用较少；
2 Bisulfite转化后的文库GC占比失衡，AT会过度测序，难以真实反应样本表观修饰情况；
3 回收率极低，通常仅为10%左右。
甲基化转化新选择：TET酶
TET (Ten-eleven translocation)酶是生物体内存在的一种α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依赖的双加氧酶，在靠近C端拥有一个催化结构域DBSH，该结构域具有金属离子（Fe2+）和α-KG的结合位点，催化结构域前还有一段富含半胱氨酸区。TET蛋白生物功能的发现为5mC的去甲基化机制提供了新的见解，该蛋白将5mC转化为5hmC后，可继续催化5hmC转化为5fC和5caC，然后在TDG（胸腺嘧啶-DNA糖苷酶）的作用下生成C。在TET、TDG和DNMT的共同作用下，可实现DNA上同一位点的3种碱基类型C、5mC和5hmC动态平衡（图2）。
图2.DNA甲基化和去甲基化的过程（Kao et al., 2016；J. Clin. Med.）
根据TET酶的作用原理，NEB推出的使用TET2通过级联反应将5mC和5hmC氧化成5caC，5hmC在糖基化的作用下转化成5ghmC，随后利用脱氨酶APOBEC将C转换成U、PCR扩增后进行甲基化位点鉴定（图3B）。尽管该方法能够减少DNA损伤，但与BS-seq类似，它也是将DNA上未发生甲基化的C转变成U，转化后的文库存在GC占比存在失衡等现象。
图3.甲基化转化原理流程对比
Liu（2019）等人开发出的DNA甲基化转化方法采取的策略是将甲基化的C转化成U，用以解决将未修饰的C转换为U导致的序列复杂性降低、测序质量差、定位效率低等问题。该方法使用NgTET1/mTET1将5mC和5hmC氧化成5caC、随后5caC经转化剂处理转化成U、PCR扩增后用于建库测序（图3C）。相较于BS-seq，该方法具有对DNA的损伤小、覆盖度更高等优势，为在单碱基分辨率下准确的鉴定DNA甲基化位点提供新的思路。但该方法目前存在转化效率偏低、而TET酶的活性很大程度上影响转化效率。
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作为甲基化C转化成U过程中最关键的酶TET，其活性的提高将有助于转化效率的提升。翌圣生物长期专注于分子酶产品的创新研发，通过对纳氏虫属DNA双加氧酶（NgTET1）进行定向有理改造，获得重组融合突变体蛋白eTET1，该酶的活性显著高于NgTET1和mTET1（图4）。
图4.eTET1与其他TET酶活性比较
订购信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
12219ES60 | 50 μg | |
12219ES76 | 300 μg | |
12219ES80 | 600 μg |
参考文献»
[1] Kao S H, Wu K J, Lee W H. Hypoxia, epithelial-mesenchymal transition, and TET-mediated epigenetic changes[J]. Journal of clinical medicine, 2016, 5(2): 24.
[2]
Liu Y, Siejka-Zielińska P, Velikova G, et al. Bisulfite-free direct
detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base
resolution[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(4): 424-429.
