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聚焦类器官(4)- 小鼠小肠类器官构建指南

类器官(organoids)是指利用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物并具有一定的空间结构组织类似物。2021年,类器官技术被列为“十四五”国家重点研发专项,作为疾病模型,相比于传统2D疾病模型,类器官在阐明疾病的发展、稳态性和发病机理等与体内环境更加接近,在多领域将发挥重要,诸如细胞治疗、药物研发、基因工程、免疫研究、组织再生等领域。

 

下面将通过讲述小鼠小肠类器官培养的全过程及相关注意事项为大家在培养过程中减少踩坑概率。

 

小鼠肠原代培养方法

01

样本制备:小鼠断颈处死,表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3 - 15 cm肠组织,用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪后并放入4℃预冷的含1%双抗DPBS溶液中。

02

样本清洗:使用注射器冲洗肠道2 - 3次,用手术剪将肠管小心剪开,肠腔面朝上,用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛,待肠绒毛被刮净后(呈现组织透明),将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗2 - 3次。

03

样本初处理:将清洗后的小肠组织剪碎至2 mm大小块状体,顺势转移至新的50 mL离心管中,用DPBS轻柔清洗3 - 5次,除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。

04

样本消化:在小肠碎片组织加入10 - 15 mL含有3 - 5 mM EDTA 的预冷 DPBS 中消化,4℃孵育30 min左右,期间每10 min轻摇一次离心管。 

05

消化完成后,弃去EDTA消化液上清,用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2 - 3次以去除剩余的EDTA。

06

在小肠组织碎片中加入10 - 15 mL预冷的含0.1%BSA的DPBS,反复吹打、重悬组织碎片,使隐窝与基底层分离,然后取少许悬液镜检,当发现有隐窝样结构后,停止吹打,并对吹打后的组织悬液使用70 μm滤网过滤并收集穿过滤网的组织悬液。

07

重复步骤5 - 6两次,1500 rpm、4℃离心3 min。

08

混合物形成:用Ceturegel®基质胶重悬隐窝组织沉淀,每10 μL基质胶悬液包含200~600个隐窝,重悬后混合液置于冰上,尽快操作以避免基质胶形成凝胶。

09

将混合悬液种植于24孔板底部正中央,每孔30 - 50 μL左右,避免悬液接触孔板侧壁。

10

将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中,孵育30min左右待Ceturegel®基质胶凝固。

11

待Ceturegel®基质胶完全凝固后,沿壁缓慢加入已配制好的Cebrary® Intestinal Organoid Growth Medium (Mouse) 小鼠肠类器官生长培养基,每孔800 μL直至完全浸没混合物。

12

将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并观察类器官生长状态,一般小鼠小肠类器官在5~7天内形成。

 

翌圣类器官培养解决方案

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  • 开瓶即养:成分全部按“黄金比例”预混,无需再为浓度、批次差异反复调试;

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  • 稳定省心:无血清,批间差异 CV<10 %,实验成功率提升 30 %。

 

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  • 节约成本:成本直降 40 %;

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