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高通量测序(NGS)——文库构建疑难问题解读

1. 建库试剂盒


Q: 建库接头添加量如何计算?

A: 公式:Input DNA 摩尔数(pmol)≈ Input DNA 质量(ng)/ [0.66 × Input DNA 平均长度(bp)]。

举例:Input DNA 100ng,长度 300bp,那么接头应该添加多少? 根据公式,计算 Input DNA 摩尔数(pmol)=100÷(0.66×300)=0.5pmol 根据接头添加比例 100:1,接头摩尔比=100×0.5=50pmol 接头添加量=接头摩尔比(50pmol)÷接头浓度(15μmol/L)=3.34μL 备注:15μmol/L=15pmol/μLa


2. 建库磁珠


Q: 磁珠回收率低是怎么回事?


A: 1) 峰形问题,回收的峰窄时,计算所得回收率低,不影响测序。

2) 操作问题,孵育时间不足。保证孵育时间在 5min,长片段可孵育 10min。

3) 操作问题,第二轮移器上清时吸到磁珠。如做分选,可在 200μL 枪头前串联 10μL 枪头用于移液,可防止吸到磁珠。

4) 操作问题,磁珠使用比例不对。如做分选,应使用说明书中推荐的磁珠比例。

5) 操作问题,洗涤时用的乙醇浓度低。使用新鲜配制的乙醇,浓度至少在 70%以上。

6) 操作问题,干燥过度。洗脱前,如果磁珠干燥过度,会使 DNA 紧紧吸附于磁珠上,不易洗脱。防止过度干燥,观察磁珠表面无液体至刚刚出现龟裂即可。

7) 操作问题,洗脱液体积不足。水应完全覆盖磁珠。

8) 操作问题,磁珠与 DNA 混匀不充分。保证充分混匀,充分吸附。


Q: 磁珠可以吸附单链 DNA 和 RNA 吗?

A: 1) 可以回收单链 DNA。附件是 Beckman 磁珠回收单链 DNA 的数据,可以作为参考。因为我们的三类 DNA 磁珠主要定位于双链如 PCR 或者文库产物等,所以我们没有具体测试过单链 DNA 的回收情况,客户可以自行试验一下。

2)不建议用于回收 RNA。三类 DNA 磁珠并不是 RNase-free 磁珠,所以回收单链 RNA 可能会发生降解。如果需要回收 RNA,建议使用我们的 RNA Cleaner 磁珠。


Q: Cat#12601 磁珠可以纯化基因组 DNA 吗?

A: 12601 我们测试过最大 20kb 的片段,回收率>90%。基因组 DNA 未测试过,测试时,由于大的 DNA 与磁珠结合的非常紧,所以应尽量增加洗脱液体积,避免干燥时间过久。

Q: 12601 磁珠的回收率?

A: 对于 200bp 以上的 DNA 片段,回收率在 90%以上;对于 200bp 以下的 DNA 片段,回收率在 50%左右。


3. 文库定量

Q: qPCR法文库定量,扩增效率不在 90%-110%?

A: 1. 如 Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3 或者 Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且计算扩增效率超过 100%,提示反应体系有污

染。应根据 NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或 DNA Standards 污染)。

2. 不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为 1-3 循环。

3. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

Q: qPCR法文库定量,相关系数 R2 < 0.99

A: 1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

2. 仪器相关问题,确保仪器与 ROX 匹配使用。


Q: qPCR法文库定量,标曲扩增曲线分布不均一

A: 1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反应体系有污染。

根据 NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或 DNA Standards 污染)。

2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基线基线(Baseline)设置不当。手动调整基线基线(Baseline)为 1-3。

3. DNA Standards 之间ΔCt > 3.6,提示扩增效率差。确认所有试剂使用前都已充分解冻并彻底混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。

4. 长时间强光照射会导致 qPCR Master Mix 荧光值下降,进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。


Q: qPCR法文库定量,DNA Standards 有扩增,而文库没有或 Ct 很大

A: 1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。

2. 稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。

3. 文库降解。文库应现用现稀释。