操作手册

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产品描述

 

Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 1 ng)是针对lllumina^®高通量测序平台专业开发设计的转座酶法建库试剂盒，适用于1 ng的基因组DNA、cDNA、扩增子（>500 bp）等样本的建库。与常规分步法建库相比，Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®采用新型转座酶和优化的缓冲体系，仅需10 min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程，显著缩短建库时间至1.5小时以内，并获得优异的测序质量。此外，本试剂盒已经不同GC含量DNA样本的验证，无偏好性或仅具有极低的偏好性。本试剂盒提供的所有试剂盒组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

 

产品组分

 

组分编号	组分名称	8 libraies	24 libraies	96 libraies
12206-A	5×Reaction Buffer	32 μL	96 μL	384 μL
12206-B	Transposome Mix V1	40 μL	120 μL	480 μL
12206-C	PCR Primer Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12206-D	2×Ultima Amplification Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12206-E	N5 (N501)*	8 μL	——	——
12206-F	N7 (N701)*	4 μL	——	——
12206-G	N7 (N702)*	4 μL	——	——

注意：*测序时Index序列N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA，N702-CGTACTAG。

 

运输与保存方法

 

冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。

 

注意事项

 

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打或轻轻振荡混匀，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。试剂吸取时应保证枪头适当深入液体，排出时应确认枪头无残留。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7.本产品仅用作科研用途！

二、关于产品原理

本产品基于转座酶法开发，其核心原理是转座酶及其转座机制。在Transposome Mix中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1和Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时，该转座子将Adapter 1和Adapter 2接头序列插入靶基因中，形成一端带有Adapter 1，一端带有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）两对引物扩增，产物经分选和纯化后即为可测序文库。

 

图1  Fast Tagment DNA建库试剂盒原理

三、关于DNA片段化（DNA Tagment）

1. 本试剂盒使用转座酶进行DNA片段化。如DNA样品为PCR产物，应保证其长度>500 bp。因转座酶无法作用于DNA末端，因此PCR产物最末端50 bp测序覆盖度可能会有所降低。我们推荐您在制备PCR产物时将待测区域两末端各延长50-100 bp，以避免末端测序覆盖度降低的情况。

2. 本试剂盒适用1 ng Input DNA。在Input DNA投入前，应将其纯化并溶于灭菌蒸馏水中，A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0，并使用基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等进行定量。【注意：因Transposome Mix对DNA浓度非常敏感，所以准确的DNA浓度测定对实验成功与否至关重要。】

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

5. 磁珠使用过程中，应保证移液准确性。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存1周，-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增（Library Amplification）

1. 使用本试剂盒必须进行文库扩增步骤。因转座反应产物并非完整的双链DNA文库，必须通过PCR反应生成完整的DNA文库。

2. 当Input DNA量为1 ng时，推荐使用8-15个扩增循环，13个循环的文库产出约为600 ng。

六、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用方法

 

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS^® Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）。

4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

 

 

三、操作步骤

3.1 DNA片段化（DNA Tagment）

1. 准备工作：将Hieff NGS^TM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

表1  片段化反应体系

名称	体积（μL）
1 ng Input DNA	x
5×Reaction Buffer	4
Transposome Mix V1	5
ddH2O	Up to 20 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表2所示反应程序，进行片段化反应。

 

表2  片段化反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
55°C	10 min
4°C	Hold

3.2 文库扩增（Library Amplification）

1. 提前将表3中的试剂解冻混匀，置于冰上备用。

2. 片段化程序结束后，立即将PCR管置于冰上配制表3中PCR反应体系。

表3  PCR扩增反应体系

名称	体积（μL）
片段化产物	20
PCR Primer Mix	3
N5XX*	1
N7XX*	1
2×Ultima Amplification Mix	25
ddH2O	To 50 μL

注意：*Hieff NGS^TM Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8种N5XX和12种N7XX，可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表4所示反应程序，进行PCR扩增。

表4  PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
热盖105°C	On
72°C	3 min*	1
95°C	30 sec	1
95°C	10 sec	n cycles**
55°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold

注意：*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循环数请根据测序需要进行选择。起始DNA量为1 ng时，推荐8-15个扩增循环。

3.3 文库纯化或分选（Library Clean UP/Size Selection）

如对文库长度分布无特殊要求，可直接使用1.0×磁珠纯化扩增产物，而不进行片段分选。如需进行片段分选，则进行以下步骤，推荐使用Cat#12601 DNA Selection Beads进行产物片段分选，为防止接头或大片段残留，可进行两次片段分选，或先使用1.0×磁珠纯化扩增产物后再进行分选。

1. 将平衡至室温的Hieff NGS^TM DNA Selection Beads磁珠，振荡或上下颠倒混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，进行双轮分选时，需将初始DNA样本用灭菌蒸馏水补齐至100 μL，参考表5推荐比例向文库上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温孵育5 min。【注意：因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50 μL，进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至100 μL，否则分选长度会与预期不一致。】

表5  磁珠文库分选推荐比例

文库平均总长度	~300 bp	~400 bp	~500 bp	~800 bp
第一轮磁珠用量	80 μL (0.8×)	70 μL (0.7×)	60 μL (0.6×)	50 μL (0.5×)
第二轮磁珠用量	20 μL (0.2×)	20 μL (0.2×)	20 μL (0.2×)	15 μL (0.15×)

注意：“×”数均根据PCR产物体积补齐至100 μL计算而得，如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。

4. 参考表5向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重复步骤9，总计漂洗两次。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中，于-20℃保存。此外，如需获得长度分布更集中的文库扩增产物，可使用胶回收方式进行长度分选和纯化；如对文库长度分布范围等无特殊要求，扩增产物也可不进行长度分选，直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。

3.4 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。

3.5 参考实例

使用Hieff NGS^TM Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®对1 ng嗜盐杆菌gDNA样本建库，并分别使用1.0×磁珠进行纯化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例进行长度分选，结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

 

图3  Agilent 2100 Bioanalyzer文库质量分析

 

HB210811