操作手册
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)是针对lllumina®高通量测序平台专业开发设计的转座酶法建库试剂盒,适用于1 ng的基因组DNA、cDNA、扩增子(>500 bp)等样本的建库。与常规分步法建库相比,Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®采用新型转座酶和优化的缓冲体系,仅需10 min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程,显著缩短建库时间至1.5小时以内,并获得优异的测序质量。此外,本试剂盒已经不同GC含量DNA样本的验证,无偏好性或仅具有极低的偏好性。本试剂盒提供的所有试剂盒组分,都经过严格的质量与功能验证,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。
组分编号 |
组分名称 |
8 libraies |
24 libraies |
96 libraies |
12206-A |
5×Reaction Buffer |
32 μL |
96 μL |
384 μL |
12206-B |
Transposome Mix V1 |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
12206-C |
PCR Primer Mix |
24 μL |
72 μL |
288 μL |
12206-D |
2×Ultima Amplification Mix |
200 μL |
600 μL |
2×1200 μL |
12206-E |
N5 (N501)* |
8 μL |
—— |
—— |
12206-F |
N7 (N701)* |
4 μL |
—— |
—— |
12206-G |
N7 (N702)* |
4 μL |
—— |
—— |
注意:*测序时Index序列N501-TAGATCGC,N701-TAAGGCGA,N702-CGTACTAG。
冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打或轻轻振荡混匀,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。
7.本产品仅用作科研用途!
二、关于产品原理
本产品基于转座酶法开发,其核心原理是转座酶及其转座机制。在Transposome Mix中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1和Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时,该转座子将Adapter 1和Adapter 2接头序列插入靶基因中,形成一端带有Adapter 1,一端带有Adapter 2的DNA,之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经N5(N5XX)和N7(N7XX)以及P5和P7(PCR Primer Mix)两对引物扩增,产物经分选和纯化后即为可测序文库。
图1 Fast Tagment DNA建库试剂盒原理
三、关于DNA片段化(DNA Tagment)
1. 本试剂盒使用转座酶进行DNA片段化。如DNA样品为PCR产物,应保证其长度>500 bp。因转座酶无法作用于DNA末端,因此PCR产物最末端50 bp测序覆盖度可能会有所降低。我们推荐您在制备PCR产物时将待测区域两末端各延长50-100 bp,以避免末端测序覆盖度降低的情况。
2. 本试剂盒适用1 ng Input DNA。在Input DNA投入前,应将其纯化并溶于灭菌蒸馏水中,A260/A280 = 1.8-2.0,并使用基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等进行定量。【注意:因Transposome Mix对DNA浓度非常敏感,所以准确的DNA浓度测定对实验成功与否至关重要。】
四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
3. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
5. 磁珠使用过程中,应保证移液准确性。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增(Library Amplification)
1. 使用本试剂盒必须进行文库扩增步骤。因转座反应产物并非完整的双链DNA文库,必须通过PCR反应生成完整的DNA文库。
2. 当Input DNA量为1 ng时,推荐使用8-15个扩增循环,13个循环的文库产出约为600 ng。
六、关于文库质检(Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
一、自备材料
1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. 文库质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。
3. N5(N5XX)和N7(N7XX)Index引物: Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)(Cat#12610ES96)。
4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
三、操作步骤
3.1 DNA片段化(DNA Tagment)
1. 准备工作:将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。
表1 片段化反应体系
名称 |
体积(μL) |
1 ng Input DNA |
x |
5×Reaction Buffer |
4 |
Transposome Mix V1 |
5 |
ddH2O |
Up to 20 μL |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表2所示反应程序,进行片段化反应。
表2 片段化反应程序
温度 |
时间 |
热盖105°C |
On |
55°C |
10 min |
4°C |
Hold |
3.2 文库扩增(Library Amplification)
1. 提前将表3中的试剂解冻混匀,置于冰上备用。
2. 片段化程序结束后,立即将PCR管置于冰上配制表3中PCR反应体系。
表3 PCR扩增反应体系
名称 |
体积(μL) |
片段化产物 |
20 |
PCR Primer Mix |
3 |
N5XX* |
1 |
N7XX* |
1 |
2×Ultima Amplification Mix |
25 |
ddH2O |
To 50 μL |
注意:*Hieff NGSTM Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)(Cat#12610ES96)中提供8种N5XX和12种N7XX,可根据样品数量和Index选择策略自行选择。
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表4所示反应程序,进行PCR扩增。
表4 PCR扩增反应程序
温度 |
时间 |
循环数 |
热盖105°C |
On |
|
72°C |
3 min* |
1 |
95°C |
30 sec |
1 |
95°C |
10 sec |
n cycles** |
55°C |
30 sec |
|
72°C |
30 sec |
|
72°C |
5 min |
1 |
4°C |
Hold |
注意:*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA,72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。
**循环数请根据测序需要进行选择。起始DNA量为1 ng时,推荐8-15个扩增循环。
3.3 文库纯化或分选(Library Clean UP/Size Selection)
如对文库长度分布无特殊要求,可直接使用1.0×磁珠纯化扩增产物,而不进行片段分选。如需进行片段分选,则进行以下步骤,推荐使用Cat#12601 DNA Selection Beads进行产物片段分选,为防止接头或大片段残留,可进行两次片段分选,或先使用1.0×磁珠纯化扩增产物后再进行分选。
1. 将平衡至室温的Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀。
2. 根据DNA片段长度要求,进行双轮分选时,需将初始DNA样本用灭菌蒸馏水补齐至100 μL,参考表5推荐比例向文库上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温孵育5 min。【注意:因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50 μL,进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至100 μL,否则分选长度会与预期不一致。】
表5 磁珠文库分选推荐比例
文库平均总长度 |
~300 bp |
~400 bp |
~500 bp |
~800 bp |
第一轮磁珠用量 |
80 μL (0.8×) |
70 μL (0.7×) |
60 μL (0.6×) |
50 μL (0.5×) |
第二轮磁珠用量 |
20 μL (0.2×) |
20 μL (0.2×) |
20 μL (0.2×) |
15 μL (0.15×) |
注意:“×”数均根据PCR产物体积补齐至100 μL计算而得,如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL。
3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。
4. 参考表5向上清中加入第二轮分选磁珠。
7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。
8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。
10. 重复步骤9,总计漂洗两次。
11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。
12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。
13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中,于-20℃保存。此外,如需获得长度分布更集中的文库扩增产物,可使用胶回收方式进行长度分选和纯化;如对文库长度分布范围等无特殊要求,扩增产物也可不进行长度分选,直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。
3.4 文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。
3.5 参考实例
使用Hieff NGSTM Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®对1 ng嗜盐杆菌gDNA样本建库,并分别使用1.0×磁珠进行纯化,0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例进行长度分选,结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。
图3 Agilent 2100 Bioanalyzer文库质量分析
HB210811