产品描述
天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白G(Protein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG。然而两者结合特异性上有所不同(详细见附录1,蛋白A,G对不同物种Ig的结合能力总表),如蛋白G对人IgG3,大鼠IgG2a,绵羊IgG1具有很高的亲和力,但蛋白A对这些Ig结合力很弱。蛋白A,蛋白G常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上,直接用以做免疫沉淀(IP)或者免疫共沉淀(Co-IP)来进行蛋白功能相关研究,或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。
本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,适合于所有蛋白A琼脂糖珠和蛋白G琼脂糖珠单独可以结合的Ig,实用性更高。
产品性质
基质(Matrix) |
高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体(Ligand) |
重组蛋白A/G |
孔径(Bead size) |
45-165 µm |
最大流速(Flowmax) |
0.3 MPa,3 bar |
储存缓冲液(Buffer) |
含20%乙醇的1×PBS |
载量(Capacity) |
约20 mg human I gG/ mL 基质 |
pH范围(pH range) |
3-10 |
运输与保存方法
冰袋运输。2-8℃保存,2年有效。
需准备试剂
【注】建议以下缓冲液在使用前用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。
结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH7.0
洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0
中和液:1 M Tris-HCl,pH 8.5
交联缓冲液:0.2 M 三乙醇胺,pH8.2
终止液:50 mM Tris-HCl,pH 7.5
使用方法
一、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):
1蛋白样品的准备:
① 贴壁细胞:取10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤2次,然后加入500 µL至2 mL细胞裂解液裂解细胞(如RIPA裂解液);
② 悬浮细胞:离心收集细胞后,PBS洗涤1次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解;
③ 动植物组织样本:参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解;
【注】a)具体的裂解方法,应参考不同裂解液的详细使用方法;b)不同量的细胞,应选用适当裂解液的用量进行裂解(如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量),通常裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1ug/ul范围内较合适;c)可选:细胞或组织处理时加入广谱核酸酶Benzonase(Yeasen Cat#20125),能够降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线形和环状),而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景,保障实验的可重复性。
2 去除非特应性结合(可选):
① 取0.2-1 mL 细胞或组织裂解液,蛋白量约为0.2-1 mg,加入约1 µg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20 µL充分重悬的rProtein A/G Agarose Resin 4FF,4℃缓慢摇动30 min~2 h。
② 2500 rpm(约1000 g)离心5 min,取上清用于后续的免疫沉淀。
【注】 所谓种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步骤可以预先去除样本与rProtein A/G Agarose Resin 4FF的非特异性结合,降低背景。
3 免疫沉淀:
1)抗体吸附
① 取适量rProtein A/G Agarose Resin 4FF加入到2 mL离心管中,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
② 加入0.5 mL结合缓冲液重悬树脂,500 rpm离心1 min,吸弃上清。继续重复2次此操作。
③ 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液,重悬树脂,室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀30 min后,500 rpm离心1 min,收集上清液,备用,待检测。
④ 向上述树脂中加入0.5 mL的洗杂缓冲液,重悬树脂对其进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,500 rpm离心1 min,吸弃上清。再重复2次。
2)抗体交联(可选)
【注】如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略此步骤。
① 向清洗过的树脂中加入1 mL交联Buffer,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
② 再向其中加入1 mL 20 mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联Buffer,该试剂需现配现用,重悬树脂,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转,促使Buffer 和树脂充分接触,30 min后,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
③ 再向其中加入1 mL终止液,重悬树脂,终止交联反应,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15 min,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
④ 加入0.5 mL洗杂缓冲液,重悬树脂,进行清洗,500 rpm离心1min,吸弃上清。再重复2次。
3)沉淀反应
① 抗原吸附:向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10 min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1 h或者在4℃下反应过夜。
② 洗杂:将上述完成抗原吸附的产物500 rpm 离心1 min,收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入1 mL洗杂缓冲液,用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀,500 rpm离心 1 min,弃上清。重复2次,最后加入1 mL洗杂液,将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
4 样品洗脱
【注】根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。
1) 变性洗脱:该方法适于SDS-PAGE检测。向上述离心管中加入25 µL 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀,95℃加热5 min。500 rpm 离心1 min,收集上清进行后续WB分析。
2)非变性洗脱:该法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析。具体做法:向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入5倍体积的洗脱Buffer,用移液器轻轻吹打数次,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10 min,500 rpm离心1 min,吸取上清,收集洗脱组分,即为目标抗原,将其收集至新的离心管中,立即加入1/10体积的中和液,将洗脱组分PH调至7.0-8.0,备用。
二、免疫共沉淀 (Co-IP)
1 抗原抗体的结合:将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合,室温孵育30-60 min,或者4℃孵育过夜。
【注】① 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性,需根据具体情况进行优化;② 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量,抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂80%的最大载量。
2 树脂准备:
1)取适量rProtein A/G Agarose Resin 4FF加入到2 mL离心管中,500 rpm离心1 min,吸弃上清。
2)加入0.5 mL结合Buffer 重悬树脂,500 rpm离心1 min,吸弃上清。继续重复2次此操作。
3 抗原-抗体混合物的吸附:将步骤1中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中,混匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转30 min,使其充分接触并吸附,500 rpm离心1 min,收集上清留待检测。
4 洗杂:向上述离心管中加入0.5 mL洗杂缓冲液,重悬树脂,去除非特异性结合,500 rpm离心1 min,吸弃上清。再重复2次此操作。
5 抗原洗脱(根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法,同免疫沉淀法洗脱)
注意事项
1)请勿冷冻保存本产品。
2)Protein A/G琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次,使琼脂糖珠混合均匀。
3)所有操作过程中,样本需要在4℃或冰上操作。
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
5)本产品仅作科研用途!
附录 蛋白A,G对不同物种Ig的结合能力总表(见下)
免疫球蛋白亚型 |
Protein A |
Protein G |
免疫球蛋白亚型 |
Protein A |
Protein G |
Human IgG |
++++ |
++++ |
Mouse IgG |
++++ |
++++ |
Human IgG1 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG1 |
+ |
++++ |
Human IgG2 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG2a |
++++ |
++++ |
Human IgG3 |
+ |
++++ |
Mouse IgG2b |
+++ |
+++ |
Human IgG4 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG3 |
++ |
+++ |
Human IgM |
Use anti-Human IgM |
Mouse IgM |
Use anti-Mouse IgM |
||
Human IgE |
NR |
NR |
Chicken IgG (IgY) |
NR |
NR |
Human IgA |
+ |
NR |
Cow IgG |
++ |
++++ |
Human IgA1 |
+ |
NR |
Goat IgG |
+ |
++++ |
Human IgA2 |
+ |
NR |
Goat IgG1 |
+ |
++++ |
Human IgD |
Use anti-Human IgD |
Goat IgG2 |
++++ |
++++ |
|
Rat IgG |
+ |
++ |
Goat IgM |
NR |
NR |
Rat IgG1 |
NR |
+ |
Guinea Pig IgG |
++++ |
++ |
Rat IgG2a |
NR |
++++ |
Guinea Pig IgG1 |
++++ |
++ |
Rat IgG2b |
NR |
+ |
Guinea Pig IgG2 |
++++ |
++ |
Rat IgG3 |
+ |
++ |
Hamster IgG |
+ |
++ |
Sheep IgG |
+ |
++ |
Horse IgG |
+ |
++++ |
Sheep IgG1 |
+ |
++ |
Rabbit IgG |
++++ |
+++ |
Sheep IgG2 |
+ |
++ |
Rabbit IgM |
NR |
NR |
Sheep IgM |
NR |
NR |
Rabbit All isotypes |
+++ |
++ |
Pig IgG |
+++ |
+++ |
Monkey IgG |
++++ |
++++ |
Cat IgG |
++++ |
+ |
Donkey IgG |
++ |
++++ |
Dog IgG |
++++ |
+ |
|
|
|
(+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested; |
HB210830