rProtein A/G Agarose Resin 4FF 蛋白A/G琼脂糖快速纯化树脂

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产品描述

 

天然蛋白AProtein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白GProtein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG。然而两者结合特异性上有所不同(详细见附录1,蛋白AG对不同物种Ig的结合能力总表),如蛋白G对人IgG3,大鼠IgG2a,绵羊IgG1具有很高的亲和力,但蛋白A对这些Ig结合力很弱。蛋白A,蛋白G常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上,直接用以做免疫沉淀(IP)或者免疫共沉淀(Co-IP)来进行蛋白功能相关研究,或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。

本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,适合于所有蛋白A琼脂糖珠和蛋白G琼脂糖珠单独可以结合的Ig,实用性更高。

 

产品性质

 

基质(Matrix

高度交联的4%琼脂糖微球

配体(Ligand

重组蛋白A/G

孔径(Bead size

45-165 µm

最大流速(Flowmax

0.3 MPa,3 bar

储存缓冲液(Buffer

20%乙醇的1×PBS

载量(Capacity

20 mg human I gG/ mL 基质

pH范围(pH range

3-10

 

运输与保存方法

 

冰袋运输。2-8保存,2年有效。

 

需准备试剂

 

【注】建议以下缓冲液在使用前用0.22 μm0.45 μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH7.0

洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0

中和液:1 M Tris-HClpH 8.5

交联缓冲液:0.2  M 三乙醇胺,pH8.2

终止液:50 mM Tris-HClpH 7.5

 

使用方法

 

一、免疫沉淀(ImmunoprecipitationIP:

1蛋白样品的准备:

 贴壁细胞:取10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤2次,然后加入500 µL2 mL细胞裂解液裂解细胞(如RIPA裂解液);

 悬浮细胞:离心收集细胞后,PBS洗涤1次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解;

 动植物组织样本:参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解;

a)具体的裂解方法,应参考不同裂解液的详细使用方法;b)不同量的细胞,应选用适当裂解液的用量进行裂解(如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量),通常裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1ug/ul范围内较合适c可选:细胞或组织处理时加入广谱核酸酶BenzonaseYeasen Cat#20125),能够降解所有形式的DNARNA(单链、双链、线形和环状),而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景,保障实验的可重复性。

2 去除非特应性结合(可选):

 0.2-1 mL 细胞或组织裂解液,蛋白量约为0.2-1 mg,加入约1 µg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG20 µL充分重悬的rProtein A/G Agarose Resin 4FF4℃缓慢摇动30 min~2 h

 2500 rpm(约1000 g)离心5 min,取上清用于后续的免疫沉淀。

所谓种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步骤可以预先去除样本与rProtein A/G Agarose Resin 4FF的非特异性结合,降低背景。

3 免疫沉淀:

1)抗体吸附

 取适量rProtein A/G Agarose Resin 4FF加入到2 mL离心管中,500 rpm离心1 min,吸弃上清。

 加入0.5 mL结合缓冲液重悬树脂,500 rpm离心1 min,吸弃上清。继续重复2次此操作。

 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液,重悬树脂,室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀30 min后,500 rpm离心1 min,收集上清液,备用,待检测。

 向上述树脂中加入0.5 mL的洗杂缓冲液,重悬树脂对其进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,500 rpm离心1 min,吸弃上清。再重复2次。

2)抗体交联(可选)

【注】如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略此步骤。

 向清洗过的树脂中加入1 mL交联Buffer500 rpm离心1 min,吸弃上清。

 再向其中加入1 mL 20 mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联Buffer,该试剂需现配现用,重悬树脂,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转,促使Buffer 和树脂充分接触,30 min后,500 rpm离心1 min,吸弃上清。

 再向其中加入1 mL终止液,重悬树脂,终止交联反应,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15 min500 rpm离心1 min,吸弃上清。

 加入0.5 mL洗杂缓冲液,重悬树脂,进行清洗,500 rpm离心1min,吸弃上清。再重复2次。

3)沉淀反应

 抗原吸附:向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10 min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1 h或者在4℃下反应过夜。

 洗杂:将上述完成抗原吸附的产物500 rpm 离心1 min,收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入1 mL洗杂缓冲液,用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀,500 rpm离心 1 min,弃上清。重复2次,最后加入1 mL洗杂液,将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中,500 rpm离心1 min吸弃上清。

4 样品洗脱

【注】根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。

1) 变性洗脱:该方法适于SDS-PAGE检测。向上述离心管中加入25 µL 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀,95℃加热5 min500 rpm 离心1 min,收集上清进行后续WB分析。

2)非变性洗脱:该法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析。具体做法:向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入5倍体积的洗脱Buffer,用移液器轻轻吹打数次,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10 min500 rpm离心1 min,吸取上清,收集洗脱组分,即为目标抗原,将其收集至新的离心管中,立即加入1/10体积的中和液,将洗脱组分PH调至7.0-8.0,备用。

 

二、免疫共沉淀 Co-IP

1 抗原抗体的结合:将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合,室温孵育30-60 min,或者4℃孵育过夜。

【注】 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性,需根据具体情况进行优化; 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量,抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂80%的最大载量。

2 树脂准备:

1)取适量rProtein A/G Agarose Resin 4FF加入到2 mL离心管中,500 rpm离心1 min,吸弃上清。

2)加入0.5 mL结合Buffer 重悬树脂,500 rpm离心1 min,吸弃上清。继续重复2次此操作。

3 抗原-抗体混合物的吸附:将步骤1中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中,混匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转30 min,使其充分接触并吸附,500 rpm离心1 min,收集上清留待检测。

4 洗杂:向上述离心管中加入0.5 mL洗杂缓冲液,重悬树脂,去除非特异性结合,500 rpm离心1 min,吸弃上清。再重复2次此操作。

5 抗原洗脱(根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法,同免疫沉淀法洗脱)

 

注意事项

 

1)请勿冷冻保存本产品。

2Protein A/G琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次,使琼脂糖珠混合均匀。

3)所有操作过程中,样本需要在4℃或冰上操作。

4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5)本产品仅作科研用途!

 

附录  蛋白AG对不同物种Ig的结合能力总表(见下)

免疫球蛋白亚型

Protein A

Protein G  

免疫球蛋白亚型

Protein A

Protein G  

Human IgG

++++

++++

Mouse IgG

++++

++++

Human IgG1

++++

++++

Mouse IgG1

+

++++

Human IgG2

++++

++++

Mouse IgG2a

++++

++++

Human IgG3

+

++++

Mouse IgG2b

+++

+++

Human IgG4

++++

++++

Mouse IgG3

++

+++

Human IgM

Use anti-Human IgM

Mouse IgM

Use anti-Mouse IgM

Human IgE

NR

NR

Chicken IgG (IgY)

NR

NR

Human IgA

+

NR

Cow IgG

++

++++

Human IgA1

+

NR

Goat IgG

+

++++

Human IgA2

+

NR

Goat IgG1

+

++++

Human IgD

Use anti-Human IgD

Goat IgG2

++++

++++

Rat IgG

+

++

Goat IgM

NR

NR

Rat IgG1

NR

+

Guinea Pig IgG

++++

++

Rat IgG2a

NR

++++

Guinea Pig IgG1

++++

++

Rat IgG2b

NR

+

Guinea Pig IgG2

++++

++

Rat IgG3

+

++

Hamster IgG

+

++

Sheep IgG

+

++

Horse IgG

+

++++

Sheep IgG1

+

++

Rabbit IgG

++++

+++

Sheep IgG2

+

++

Rabbit IgM

NR

NR

Sheep IgM

NR

NR

Rabbit All isotypes

+++

++

Pig IgG

+++

+++

Monkey IgG

++++

++++

Cat IgG

++++

+

Donkey IgG

++

++++

Dog IgG

++++

+

 

 

 

(+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested;

HB210830

 

400-6111-883