Hifair^® V Reverse Transcriptase是在Hieff^® M-MLV (H^-) Reverse Transcriptase基础上通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，与Hieff^® M-MLV (H^-) Reverse Transcriptase相比，其热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^® V Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。

 

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		14603ES03 (1000 kU)	14603ES25 (25000 kU)	14603ES72 (250000 kU)
14603-A	Hifair® V Reverse Transcriptase (1000 U/μL)	1 mL	25 mL	250 mL

 

产品应用

一步法RT-qPCR；基因克隆；荧光定量。

 

活性定义

以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10 min内，将1 nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期2年。

 

注意事项

1) 请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；

2) 所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；

3) 为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；

4) 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

第一链cDNA合成操作步骤

1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量）

组分	使用量
RNase free ddH2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM)	1 μL
or Random Primers (50 μM)	or 1 μL
or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1-500 ng

65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后，加入下表中的逆转录反应液，并轻轻吹打混匀。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	13 μL
10 × Hifair® V Buffer (Cat#15661)	2 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (1000 U/μL)	0.2 μL
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL
RNase free ddH2O	to 20 μL

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
42℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略。

2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂二级结构的模板，可将逆转录温度提高至50-55℃。

3）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。

※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

※ 该逆转录酶也适用于一步法RT-qPCR，推荐每25 μL反应体系，添加10-20 U逆转录酶，也可根据实际情况逐步增加逆转录酶用量。

 

HB220614