产品描述

 

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI^®是针对MGI^®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于华大平台测序的文库。

试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

 

产品组分

 

 

运输与保存方法

 

冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！

Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。

 

注意事项

 

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6. 本产品仅做科研用途！

二、应用范围

本试剂盒适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：

基因表达（gene expression）

单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）

基因融合鉴定（gene fusion identification）

剪切变异体分析（splice variant analysis）

三、关于接头连接（Adapter Ligation）

1. 目前华大智造有2种序号的接头：1-128和501-596。关于其使用要求，请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外，华大智造申明：2种接头由于设计工艺不同，禁止混用，否则测序数据无法拆分！

2. 我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA	Adapter stock concentration
100–499 ng	2 μM
500–4000 ng	5 μM

*可根据不同类型Total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增（Library Amplification ）

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

 

使用方法

 

一、自备材料

1.纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效产品。

2.RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3.Adapters：详情请咨询华大智造或本公司。

4.文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

5.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

 

图1. mRNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 mRNA纯化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

1. 将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。

2. 准备一个Nuclease free离心管，取10 ng-4 μg总RNA，用Nuclease Free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。

3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。

4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA与捕获磁珠的结合。

5. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。

6. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

7. 重复步骤6，共洗涤两次。

8. 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

9. 将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。

10. 将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

11. 室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。

12. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

13. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回

至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

14. 将样品从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。

表3 mRNA片段化程序推荐

插入片段大小（bp）	打断程序
200-300	94°C，10 min；
300-400	94°C，7 min；
400-500	94°C，5 min；

15. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中，立刻进入第一链合成反应（Part 2-Step 1）。

3.2 第一链cDNA的合成：

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表4 第一链cDNA合成反应体系

名称	体积（μL）
Fragmented mRNA	17
Strand Specificity Reagent	6
1st Strand Enzyme Mix	2

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表5 第一链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105°C	On
25°C	10 min
42°C	15 min
70°C	15 min
4°C	Hold

3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A：

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表6 第二链cDNA合成反应体系

名称	体积（μL）
1st Strand cDNA	25 μL
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*	30 μL
2nd Strand Enzyme Master Mix	5 μL

【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表7 第二链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105°C	on
16°C	30 min
72°C	15 min
4°C	Hold

3.4 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的MGI^®接头。

1. 参考注意事项三中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。

表8 Adapter Ligation体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头原始浓度为10 μM, 请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9所示反应程序，进行接头连接反应：

表9 Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

3.5连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录二的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。

适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

11. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

12. 重复步骤11，总计漂洗两次。

13. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

14. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

3.6 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表10中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

表10  接头连接产物PCR反应体系

组分名称	体积（μL）
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25
Primer Mix for MGI®	5
Adapter Ligated DNA	20

                         

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11示反应程序，进行PCR扩增。

表11  PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	11~15cycles*
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	-

*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见注意事项五。

3.7 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

3.8 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

附录一：mRNA片段化效果展示

 

图2. mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min处理。打断后mRNA进行进行2.2X 磁珠纯化，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。

附录二：分选条件说明

分选方案适用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200bp的文库：

方案一：接头连接产物纯化后分选

★ 0.6× Hieff NGS^® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。

★ 双轮分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为380bp~480bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，参考表12，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL(0.65×），涡旋或移液器吹打10次混匀。

3. 室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。

5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL(0.15×）。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重复步骤8。

10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表12 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度（bp）	200~300	300~400	400~500	500~600
文库长度（bp）	280~380	380~480	480~580	580~680
打断条件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一轮磁珠体积(ul)	70（0.7×）	65（0.65×）	58（0.58×）	50（0.5×）
第二轮磁珠体积 (ul)	20（0.2×）	15（0.15×）	15（0.15×）	15（0.15×）

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积0.15×100 μL=15 μL。

图3. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表12推荐的磁珠比例得到的文库大小。

方案二：接头连接产物直接分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）

500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，参考表13，在上述100 μL的DNA连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL(0.20×），涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。

4. 参考表13向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL(0.10×）。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。

6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重复步骤7。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表13 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度（bp）	200~300	300~400	400~500	500~600
文库长度（bp）	280~380	380~480	480~580	580~680
打断条件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一轮磁珠体积(μL)	25（0.25×）	20（0.2×）	15（0.15×）	15（0.15×）
第二轮磁珠体积 (μL)	10（0.1×）	10（0.1×）	10（0.1×）	10（0.1×）

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.1×100 μL=10 μL。 

HB211122