细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，发生是有时序性的，即各事件按先后顺序依次发生，最终导致凋亡小体的出现，细胞随着发生凋亡通常表现为减小体积、细胞核碎裂、胞质固缩和细胞膜破裂等特征。这些特征可以通过细胞凋亡检测方法来确定细胞是否已经凋亡。在实验中，常用的细胞凋亡检测方法包括使用荧光染料如annexin V-FITC/PI、DAPI等，荧光显微镜观察等。这些方法的原理基于不同的生物学特性，如细胞凋亡引起的胞膜磷脂移位、核酸的变化以及细胞内酶的释放等。这些生物学特性可以作为检测细胞凋亡的标志。了解细胞凋亡的特征、实验原理和过程对于深入理解细胞凋亡机制、诊断疾病、推动药物研发等方面都有重要的作用。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。

其典型特征如下：

早期凋亡：细胞膜结构发生改变，磷脂酰丝氨酸外翻；

早中期凋亡：细胞质密度增加，线粒体膜电位消失细胞膜，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆中；

中晚期凋亡：细胞凋亡信号转导；

晚期凋亡：DNA降解为180~200bp片段大小。

 

图1：细胞凋亡途径各时序性事件发生及检测方法

 

一、凋亡早期：Annexin-V/PI双染色法（PS在细胞外膜上的检测）

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，细胞发生凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜即可鉴别凋亡细胞和活细胞。

坏死的细胞PS同样也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin-V也能识别坏死细胞表面的PS,所以Annexin-V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，能够与细胞内DNA结合，而且它不能透过完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内的PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

 

图2：Annexin-V/PI双染色后流式检测结果分析

 

 

 

产品信息

 

货号	品名	规格
40302ES20	Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	20T
40302ES50		50T
40302ES60		100T
40303ES20	Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit	20T
40303ES50		50T
40303ES60		100T
40304ES20	Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit	20T
40304ES50		50T
40304ES60		100T
40305ES20	Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit	20T
40305ES50		50T
40305ES60		100T
40310ES20	Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	20T
40310ES50		50T
40310ES60		100T

 

二、凋亡早期：JC-1染色（线粒体膜电位变化的检测）

在细胞凋亡的过程中往往伴随着线粒体跨膜电位的破坏，这被广泛认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、JC-1、JC-10等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针，表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm，Em=590 nm）；而凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。JC-1的流式检测是比较常见的一种方法。
 

 

图3：JC-1的流式检测实验结果分析

 

 

 

产品信息

 

产品名称	产品编号	规格
JC-1荧光探针	40705ES03	1mg
	40705ES08	5mg
JC-10荧光探针	40707ES03	1mg
	40707ES08	5mg
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒	40706ES60	100T

 

三、凋亡晚期：TUNEL法（DNA片段原位标记法）

细胞凋亡晚期，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
 

 

图4：利用TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)检测3T3-L细胞（小鼠前脂肪细胞）凋亡情况

 

图5：利用TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)检测石蜡切片样本

 

 

 

产品信息

 

产品名称	产品编号	规格
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（FITC）	40306ES20	20T
	40306ES60	100T
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒( Alexa Fluor 488)	40307ES20	20T
	40307ES60	100T
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 640)	40308ES20	20T
	40308ES60	100T

 

 

 

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	40301ES60	100T
PI（Propidium iodide）碘化丙啶	40711ES10	10mg
	40711ES60	100mg
Rhodamine 123 罗丹明123	40712ES08	5mg
DAPI	40727ES10	10mg
DAPI溶液	40728ES10	10ml
	40728ES50	50ml
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Hoechst 33258 溶液	40730ES10	10ml
	40730ES50	50ml
Hoechst 33342	40731ES25	25mg
Hoechst 33342 溶液	40732ES10	10ml
	40732ES50	50ml