T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase),生物界的“502”

T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase），生物界的“502”

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2019-05-24

T4 DNA连接酶（T4Lig）在分子克隆和高通量测序文库构建中有着不可或缺的作用，目前市场上存在有多种类型的该产品，追本溯源这些产品对应的本质相同，那么对应本质到底是什么呢？

背景须知

DNA 连接酶是一种能够催化相邻DNA 的3’-OH 和5’- 磷酸基末段形成磷酸二酯键，并且把两段DNA 拼接起来的核酸酶。T4Lig是目前应用比较多的病毒基因组编码的DNA 连接酶，主要从缺失型嗜菌体中提取，噬菌体T4 的30 基因是该酶的合成基因。

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图1.DNA连接酶模拟结构图

结构了解

数据库中（UniProtKB登录号：P00970）显示出DNA连接酶有三个保守性结构域：DNA 结合结构域DBD（DNA-binding domain，M1~ L129），腺苷酰化结构域AdD（adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸链结合结构域OB（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。

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图2、T4lig 模拟结构，R164、R182、R359、K365 是ATP 结合位点，E217、E344 二价金属离子结合位点

作用机制

A 连接反应机理是基于切口双链DNA 底物得到的。连接反应由三步完成：

①T4 DNA ligase先由ATP供能产生E-AMP复合物；

②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5’-P基团，形成5’-P -AMP 复合物；

③3’-OH 亲核攻击5’-P-AMP 形成磷酸二酯键，并释放出AMP.

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图3、T4 DNA连接酶作用原理图

连接方法和主要应用

利用目前已知的T4Lig的连接特点，在具体的基因工程操作中，科研人员对DNA片段的连接方法分为以下三种：

（1）连接dsDNA的粘性末端：用限制性核酸内切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA 片段，利用DNA 连接酶直接连接；

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应用：载体构建，大分子条带的连接

（2）连接平末端：对于平末端的DNA 片段的连接常利用T4 DNA 连接酶连接

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应用：高保真扩增后的平末端条带的连接、平末端载体构建

（3）连接人为合成粘性末端：在DNA 片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端之后，再用DNA 连接酶将它们连接起来

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应用：NGS文库构建中接头的连接

这三种方法的原理基本一样，都是利用DNA 连接酶形成磷酸二酯键来封闭DNA 片段之间的间隙。

整理小结

T4lig最早从T4嗜菌体感染的E. coli 提取. 后来发现DNA复制缺失型嗜菌体中连接酶产量更高，作为连接酶的主要来源。人们发现T4的合成基因，了解作用机理，并逐步推广应用，目前市场供应连接酶主要通过基因工程方法生产，不同公司在此基础上经过不同基因位点的改造和筛选，使之对应的T4 DNA酶效不断提高。

上海翌圣成立于2014年，专注于分子酶的生产和改造，是一家拥有多重酶改造技术的高新技术企业；不仅生产高质量的普通T4 DNA ligase，同时利用定向改造技术，将T4 DNA ligase的有效催化活性结构域通过多轮突变筛选，得到一种连接活性更强的突变型T4 DNA ligase。

普通T4 DNA ligase可满足日常的大部分实验，具体极高的性价比。Fast T4 DNA ligase具有高效的连接能力，非常适合复杂结构核酸片段的连接，如进行FFPE和cfDNA文库的构建、华大测序平台接头的连接等。

订购信息

产品名称	货号	规格
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Hieff^® Quick T4 DNA Ligase (400 U/µL)	10301ES40	40000U
Hieff^® Fast T4 DNA ligase (400 U/µL)	10299ES40	40000U
Hieff NGS^® Ultima DNA Ligation Module	12604ES24/96	24/96T
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参考文献：

1. Lohman G J S , Chen L , Evans T C . Kinetic Characterization of Single Strand Break Ligation in Duplex DNA by T4 DNA Ligase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(51):44187-44196.

2. Martin I V , Macneill S A . ATP-dependent DNA ligases[J]. Genome Biology, 2002, 3(4):reviews3005(1-7).

3. Rossi, R. Functional characterization of the T4 DNA ligase: a new insight into the mechanism of action[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(11):2106-2113.

4. 徐广志. DNA连接酶的种类和作用机制[J]. 生物化工, 2018, 4(05):128-130.

5. 贺添艳, 刘亚娟, 徐文选, et al. T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能[J]. 河南科学, 2016, 34(7):1058-1062.