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上新│Cas12a:CRISPR工具箱中的新星!

 

2023年11月16日,Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因编辑疗法产品CASGEVY™(Exagaglogene autotemcel)获英国药品监管机构MHRA有条件批准上市,用于治疗治疗镰状细胞病(SCD)和输血依赖性β-地中海贫血(TDT),是全球首款获批上市的CRISPR基因编辑药物

 

图1. CASGEVY™治疗流程(Source:CRISPR Therapeutics官网)

 

CASGEVY™疗法是基于CRISPR/Cas9系统的治疗方案,CRISPR/Cas9系统因为其简单性和易于RNA编程的潜力,是所有CRISPR-Cas系统中用于基因工程开发的最佳候选系统。目前基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术已经成功应用于治疗、育种、合成生物学等各个领域。

 

CRISPR基因编辑技术,除了众所周知的CRISPR/Cas9体系外,CRISPR/Cas12a体系正凭借其独特的优势逐渐崭露头角。与CRISPR/Cas9体系相比,CRISPR/Cas12a体系在核酸酶结构域、向导RNA(gRNA)以及产生的DNA末端类型等方面都有着显著的差异,详见下表

图2. Cas9系统与Cas12系统对比[1]

 

除以上差异外,Cas12a在切割活性方面也与Cas9存在显著区别。Cas9仅具有顺式切割活性,用于DNA双链断裂。而Cas12a不仅具有顺式切割活性,还具备独特的反式切割活性,这使得它在基因编辑领域展现出更为广泛的应用潜力。

 

 

 

CRISPR/Cas12a切割活性

 
 
01
 

顺式切割活性

Cas12a由单个crRNA引导,当形成crRNA-Cas12a复合物时,它的构象会发生变化。然后,该复合物识别DNA非靶标链中特定的PAM位点。在距离PAM位点8个核苷酸(nt)的位置,RuVC结构域切割DNA靶标链,产生5’端的粘性突出末端。

02
 

反式切割活性

Cas12a能够特异性地识别并切割双链DNA(dsDNA),随后释放单链脱氧核糖核酸酶(ssDNase)活性。这种活性使得Cas12a能够无差别地裂解附近的单链DNA(ssDNA)。因此,Cas12a系统可以与LAMP等核酸检测技术相结合,为核酸检测、病原体识别等领域提供高效、灵敏且便捷的工具,展现出巨大的应用前景。

 

图3. Cas12a顺式及反式切割活性[2]

 

基于CRISPR/Cas12a广泛的应用场景,翌圣镁孚泰生物ZymeEditor(点击了解更多)酶改造及发酵纯化工艺平台新开发了来源于细菌Agathobacter rectalisArCas12a,与其它Cas12a(LbCas12a/AsCas12a)相比,其具有更高的温度适应性(25-55℃),非常适用于基因组编辑及核酸检测等应用场景。

 

 

 

ArCas12a性能展示

 
01

dsDNA高效体外切割

以dsDNA模板为靶标,加入ArCas12a、crRNA(存在与模板DNA序列互补的spacer区)进行体外切割,琼脂糖凝胶电泳检测切割效果。结果显示翌圣的ArCas12a在crRNA的引导下可高效的切割dsDNA(600 bp)产生两段切割产物(200 bp+400 bp)。

 

图4. ArCas12a顺式切割活性检测 M:Marker;C:模板dsDNA

 

02

反式切割活性强,可用于核酸检测

以dsDNA模板为靶标,加入ArCas12a、crRNA(存在与模板DNA序列互补的spacer区)及单链DNA报告探针(含有荧光报告集团)进行体外切割,当ArCas12a与crRNA及靶标DNA形成复合体后会激活反式切割活性,切割单链DNA报告探针,从而发出荧光。结果显示,翌圣ArCas12a与crRNA及模板DNA形成复合体后具有反式切割活性,可剪切单链DNA。

 

图5. ArCas12a反式切割活性检测

 

03

无核酸外切酶残留

将底物DNA与10 pmol ArCas12a共同孵育,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示翌圣的ArCas12a无核酸外切酶残留。

 

图6. ArCas12a核酸外切酶残留检测 C:阴性对照

 

04

无RNase残留

将底物RNA与5 pmol ArCas12a共同孵育,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示翌圣的ArCas12a无RNase残留。

 

图7. ArCas12a RNase酶残留检测 C:阴性对照

 

 

 

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产品分类

产品名称

产品货号

Cas12a

ArCas12a Nuclease

14702ES

Lbcpf1 (Cas12) Nuclease

11354ES

Fncpf1(Cas12) Nuclease

11353ES

Ascpf1(Cas12) Nuclease

11352ES

Cas12b

AapCas12b Nuclease

14808ES

Cas9

Cas9 Nuclease

14701ES

NLS-Cas9-EGFP Nuclease

11364ES

sgRNA合成

Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit

11355ES

 

 

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