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手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何评估RNA质量?


在上一期中,小翌阐述了RNA提取过程需注意的关键要点以帮助大家提取到高质量的RNA(《一文解锁RT-qPCR实验之RNA提取攻略》。那提取完RNA的质量到底如何评估呢?今天我给大家来分享一下。评估RNA的质量主要包含三个方面,分别是RNA的浓度、纯度和完整性

RNA浓度评估


首先我们先来复习一下OD260、OD280、OD230的含义。核酸分子所含的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键,在260nm波长处有最大吸收峰,因此,核酸的最大吸收波长为260nm,但它无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸等杂质;蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构,通常在280nm处有最大吸收峰;而碳水化合物,多肽,苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰则在230nm处,如图1。


陈1.jpg 图1. 核酸、蛋白质、污染物的最大吸收峰(图源网络)

对于RNA的浓度来说,根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下,1个OD值的光密度大约相当于40µg/ml的RNA[1],即RNA的浓度(µg/µl)= OD260×40×稀释倍数/1000。比如OD2600.16,2µl样本稀释至200µl,即稀释倍数为100,RNA的浓度(µg/µl)= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。


RNA纯度评估


一般来说,OD260/280=1.8-2.1,证明纯度较好,值得一提的是,OD260/280的比值会受到pH的影响,当用中性的水溶解RNA时候,RNA呈酸性,比值可能只有1.8-2.0之间;当用TE溶解RNA时,比值会稍偏高,可能在1.9-2.1之间。

1)OD260/280<1.8,可能有蛋白质或基因组的残留;

2)OD260/OD280 > 2.1,表明RNA有部分降解,如果直接将其反转得到的cDNA用于qPCR实验,可能会导致ct值偏大甚至没有ct值;
3)OD260/OD230 < 2.0,可能有盐离子、有机溶剂、碳水化合物等的污染,比如用trizol提取法中残留的的异硫氰酸胍会导致230nm处的吸光值升高,从而导致比值偏低。

当然了,纯度也可以通过琼脂糖琼胶电泳进行评估,如下图:
 陈2.jpg
图2. RNA中有DNA(左)或蛋白质(右)的残留

由图2可看出,若泳道上部有明显的高分子量杂带,则可能是有DNA的残留,不建议用于后续的qPCR实验,会对实验的准确性造成影响(图2左);若在胶孔处有比较亮的着色成分,则是有蛋白质的残留(图2右)。


RNA完整性评估


除了浓度、纯度外,RNA完整性也是判断RNA质量的重要指标。RNA完整性一般可通过琼脂糖凝胶电泳来进行评估。总RNA中占比达80%以上的是核糖体RNA(rRNA),因此,胶图呈现的结果主要是rRNA。


陈3.png
图3. 高质量RNA(左)和已降解RNA(右)的琼脂糖凝胶电泳胶图

对于真核生物来说,高质量的RNA通常有三条带,最亮的是28S,其次是18S,最淡的是5S。28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍(图3左),若RNA呈现弥散状,表明RNA已降解(图3右)。


小翌在与小伙伴交流的过程中发现,很多实验室没有跑RNA琼脂糖凝胶电泳的习惯,也不清楚RNA的电泳需注意哪些要点,小翌在此做些科普:

1)电泳槽和胶板经0.5 M NaOH浸泡0.5 h去除RNase;

2)缓冲液和琼脂糖凝胶都需新配制,采用RNase-free H2O配制电泳缓冲液;

3)关于marker的选择,建议使用RNA marker;

4)RNA电泳宜使用高电压短时间的方法,以防电泳过程中RNA的降解。


精品推荐


有些小伙伴反馈自己在样本的准备和RNA提取过程中都比较小心翼翼,但是提取的RNA质量还是不尽如人意,这时候就需要考虑是不是RNA提取试剂的问题了。在此,给大家介绍一款11min即可完成培养细胞RNA提取的的柱式提取试剂盒:培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231)。


产品特点


陈4.jpg

案例展示


使用培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231)和O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒各提取2份293T细胞(106个细胞)的总RNA。结果显示,该试剂盒提取到的目标RNA产量一致,但纯度更高,如表1和图4。

表1. Nanodrop测定RNA浓度和纯度
陈表1.jpg
【注】:Y1,Y2代表培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231);O1,O2代表O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒

陈5-a.jpg
图4a. hGAPDH扩增结果
陈5-b.png
图4b. hBC6扩增结果
图4. 培养细胞RNA提取试剂盒的定量结果与O品牌基本一致  取1 μL洗脱液反转录,以cDNA的10倍稀释液为模板,定量测试hGAPDHhBC6 2个基因

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RNA

提取

TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent TRIeasy™RNA提取试剂

10606ES60

100mL

553

320

MolPure® Cell RNA Kit 培养细胞RNA提取试剂盒

19231ES50

50T

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MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 细胞/组织总RNA提取试剂盒

19221ES50

50T

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MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取试剂盒

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50T

1255

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逆转录

Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60

100T

1383

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qPCR

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

11184ES08

5*1mL

663

51

103

208

4020



参考文献


【1】Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.


以上就是小翌本期给大家分享的内容,综合上一期内容,我们介绍了样本选择、样本采集与保存、RNA提取、RNA质量评估这四点内容。下期,我们将进入逆转录环节,不见不散~



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