手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(四)：如何正确选择逆转录引物？
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(三)：逆转录酶，你真的了解吗？》一文的学习，相信大家对逆转录酶有了一定的了解，但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成，逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的，逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来，小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关知识，学会如何正确选择逆转录引物。
PART 01
逆转录引物介绍
1
Oligo（dT）
2
随机引物
3
基因特异性引物
PART 02
逆转录引物优劣势比较
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引物类型 |
结合部位 |
优点 |
缺点 |
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Oligo(dT) |
真核生物mRNA3’端poly(A)尾 |
可合成全长cDNA |
1、仅扩增有polyA尾的mRNA 2、对模板质量要求高 |
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随机引物 |
RNA的许多随机可结合部位 |
适合复杂结构和微量模板 |
特异性低，小片段多 |
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基因特异性引物 |
特异性互补序列 |
特异性强，灵敏度高 |
仅合成特定的序列 |
PART 03
逆转录引物的选择
RNA类型：
1、真核生物mRNA
2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板
原因：
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物结合
2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾，故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合
RNA类型：
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板
2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板
随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转
RNA类型：
1、已知基因序列的模板
2、miRNA增加茎环结构的模板
原因：
1、针对特定序列设计的反转录引物
2、miRNA（茎环法）的反转录，需要根据基因序列设计对应的引物
【注】:为提高反转录效率，并保障获得更加完整的cDNA，建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。
PART 04
精品推荐
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RNA类型 |
引物选择 |
原因 |
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1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板 |
Oligo(dT) |
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物结合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾，故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合 |
|
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板 2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板 |
随机引物 |
随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转。 |
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1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加茎环结构的模板 |
基因特异性引物 |
1、针对特定序列设计的反转录引物 2、miRNA（茎环法）的反转录，需要根据基因序列设计对应的引物 |
PART 05
Hifair® Ⅲ 系列逆转录酶性能展示
可耐受60℃反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录
图1. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair® Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES) 在42℃-65℃下进行逆转录。取1 μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因（4.4kb）。M:1 kb DNA ladder.
图2. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板，oligo dT为引物，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9 kb）5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
线性检测范围广，Total RNA 10 pg-5 μg
图3. 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。
PART 06
相关产品
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产品定位 |
产品名称 |
货号 |
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单酶 |
11110ES92/93 |
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高灵敏度单酶 |
11111ES92/93 |
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Kit |
11119ES60 |
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Kit(含gDNA去除步骤) |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
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高灵敏Kit（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
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预混液 |
11120ES60 |
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预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11123ES60 |
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高灵敏预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
PART 07
翌圣逆转录产品已发表文献（部分）
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)
以上是小翌本期给大家分享的内容，主要介绍了逆转录引物的种类、优缺点和选择应用。下期，我们将给大家分享逆转录实验中的一些注意事项，我们下期不见不散哦~
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