手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(五)：cDNA的这2个要素，你注意到了吗？
通过往期"手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列"文章的综合学习后，相信大家已经很熟悉如何将RNA逆转录成cDNA了，但获得的cDNA，大家通常可能会用Nanodrop来测定其浓度和纯度，这样做真的是正确的吗？另外，得到的cDNA是否存在基因组DNA（gDNA）污染从而影响后续的qPCR实验呢？现在，让小翌为大家解读一下。
为什么逆转录后的cDNA不需要用Nanodrop来检测浓度与纯度呢？因为逆转录后的产物是一个混合体系（含有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分），会干扰cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在这个位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分别相当于50 ng/μL的双链DNA，37 ng/μL的单链DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。例如，就dNTP而言，即使cDNA浓度一样，但dNTP也会严重干扰其测定结果。
为此，我们专门进行了验证，以进一步说明dNTP 投入量对cDNA浓度检测结果存在的影响。以小鼠肌肉组织RNA为模板，采用Yeasen逆转录试剂盒11121ES（dNTP 组分按 1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度检测）、T品牌、V品牌试剂分别进行逆转录实验，RNA 投入量为500 ng，逆转录体系及程序分别按各自说明书进行。采用Nanodrop测定cDNA浓度，并取相同体积cDNA分别进行qPCR实验，结果证明：
不同品牌逆转录产品的cDNA浓度相差较大，但定量实验Ct值几乎一致。
逆转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异，但最终Ct值几乎一致。
表1. Nanodrop定量结果统计表
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产品 |
浓度（ng/μl） |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 1μl |
916.864/920.295 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 1.5μl |
1247.707/1235.671 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 2μl |
1603.601/1592.303 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 2.5μl |
1784.639/1780.047 |
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T品牌 |
756.293/759.956 |
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V品牌 |
1055.075/1055.137 |
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dNTP（10mM）1μl |
9477.6/9488.6 |
图1.qPCR检测结果△Ct＜1，且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系
gDNA的污染主要来源于RNA模板， 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA残留呢？可以在逆转录之前将RNA模板进行琼脂糖凝胶电泳验证。如下图所示，泳道上部有明显的高分子杂带，则可能有gDNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验的准确性造成影响。
图2. 高质量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）
如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA，可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组（以未逆转录的RNA作为模板）验证，如下图所示，NRC具有明显的扩增，表明RNA中可能含有gDNA污染。
图3. qPCR扩增曲线图。NRC：阴性对照组
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是否去除gDNA |
产品名称 |
产品特点 |
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是 |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（11121ES） |
A.逆转录条件：42℃,30 min 总RNA使用范围：1 ng-5 μg 合成cDNA长度：10 kb |
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Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)（11123ES） |
B.逆转录条件：42℃,30 min 总RNA使用范围:1 ng-5 μg 2×预混液 |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)（11139ES） |
C.逆转录条件：55℃,15 min 总RNA使用范围：10 pg-5 μg 合成cDNA长度：19.8 kb |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)（11141ES） |
D.逆转录条件：55℃,15 min 总RNA使用范围：10 pg-5 μg 4×预混液，可投入更大体积模板 |
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否 |
同A | |
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Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（11120ES） |
同B |
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同D |
Hifair®Ⅲ逆转录酶性能展示
图5. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板，oligodT为引物，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat#11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat#10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9 kb）的5’的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
出色的逆转录效率，适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因
图6. 以300 ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat#11141ES)、T品牌合成cDNA。取1 μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat#11195ES)扩增20个不同GC含量（25-65%）、不同表达丰度的基因。
线性检测范围广，Total RNA 10 pg-5 μg
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产品定位 |
产品名称 |
货号 |
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单酶 |
11110ES92/93 |
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高灵敏度单酶 |
11111ES92/93 |
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Kit |
11119ES60 |
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Kit(含gDNA去除步骤) |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
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高灵敏Kit（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
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预混液 |
11120ES60 |
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预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11123ES60 |
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高灵敏预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
YEASEN逆转录产品部分已发表文献(部分)
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)
以上是小翌本期给大家分享的内容，主要介绍了逆转录得到的cDNA浓度和纯度是否需要用Nanodrop仪测定和如何判断cDNA是否存在gDNA污染这两个问题。下期，我们将给大家介绍qPCR的背景与原理，我们下期不见不散哦~
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