手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(三)：逆转录酶，你真的了解吗？
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(二)：如何评估RNA质量？》一文的学习。相信大家已经获得了优质的RNA，即将进入逆转录环节。
对于逆转录，大家都知道它是以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补DNA (complementary DNA，cDNA)的过程（如图1）。但对于过程中起关键作用的逆转录酶，可能比较陌生。接下来，让小翌给大家介绍下逆转录酶的相关理论知识。
图1. 逆转录过程示意图
图2. 中心法则示意图
逆转录酶属于DNA聚合酶的一类，可以聚合dNTP合成cDNA链，这一过程的发生，依赖于逆转录酶的2大活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。
表1. M-MLV和AMV逆转录酶的特征比较
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M-MLV |
AMV |
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来源 |
莫洛尼鼠白血病病毒 |
禽成髓细胞瘤病毒 |
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热稳定性 |
差，37-42℃ |
好，42-55℃ |
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最适pH |
7.6 |
8.3 |
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RNase H活性 |
弱 |
强 |
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cDNA合成得率 |
较高 |
低 |
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合成长度 |
长，可达2-3kb |
短 |
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对抗复杂结构RNA的能力 |
弱 |
强 |
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优势 |
合成产物长度长、含量高 |
比M-MLV更耐热，适合具有一定复杂结构的RNA转录 |
虽然野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性差，抵抗复杂结构的RNA能力弱，但通过对其进行改造可弥补这些不足。渐渐地，改造后的M-MLV逆转录酶成为了市场的主流产品。
为了提高M-MLV的逆转录能力，翌圣生物在野生型M-MLV的基础上通过基因工程技术开发出了Hifair®系列逆转录酶，包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆转录酶。
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产品形式 |
产品名称和编号 |
引物 |
适用实验类型 |
产品特点 |
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单酶 |
Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES |
无 |
PCR/qPCR |
A.逆转录条件：42℃,30min 总RNA使用范围：1ng-5μg 合成cDNA长度：10kb |
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B.逆转录条件：55℃,15min 总RNA使用范围：10pg-5μg 合成cDNA长度：19.8kb |
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酶和buffer 分开 |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)/11121ES |
单独成管的oligodT、random primer |
PCR/qPCR
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同A |
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同B |
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酶和buffer预混 |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)/11123ES |
按比例预混的oligodT、random primer |
qPCR |
C.逆转录条件：42℃,30min 总RNA使用范围:1ng-5μg 2×预混液 |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES |
D.逆转录条件：55℃,15min 总RNA使用范围：10pg-5μg 4×预混液，可投入更大体积模板 |
◎ 可耐受60℃反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录
图3. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)在42℃-65℃下进行逆转录。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因（4.4kb）。M:1kb DNA ladder.
◎ 优越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板，oligodT为引物，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
◎ 出色的逆转录效率，适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因
图5. 以300ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量（25-65%）、不同表达丰度的基因。
◎ 线性检测范围广，Total RNA 10pg-5μg
图6.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。
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产品定位 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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单酶 |
11110ES92/93 |
1/5×10KU |
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高灵敏度单酶 |
11111ES92/93 |
1/5×10KU |
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Kit |
11119ES60 |
100T |
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Kit(含gDNA去除步骤) |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
100T |
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高灵敏Kit（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
100T |
|
预混液 |
11120ES60 |
100T |
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预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) |
11123ES60 |
100T |
|
高灵敏预混液（含gDNA去除步骤） |
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
100T |
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[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2]. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
[3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4]. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5]. Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)
手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列：如何评估RNA质量？
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