Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20-30  之间的最佳上样量。

(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。 Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A：a)有效性要满足三个条件：

（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为

-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。

（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3） 熔解曲线：为单一峰。

b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q：Rox 的作用？

A：ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

Q：为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？

A：可能原因：

a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。

b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

解决方案：

a）先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度RNA 重新实验。

b）定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。

Q：为什么扩增曲线无法达到平台期？

A：可能原因：

a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如  Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。

b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。

c）试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。

解决方案：

a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。

b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。

c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。

d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）

Q：为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？

A：较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。

解决方案：

a）适当提高退火温度； b）提高模板量，降低引物浓度； c）重新设计引物。

Q：为什么出现双峰，双峰 Tm 都在 80℃以前？

A：双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。

优化方法：提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

Q：为什么出现双峰，并且双峰Tm 都在 80℃以后？

A：可能原因：

a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。

b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。

解决方案：

a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。

b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。

c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

Q：为什么是单峰，但 Tm 在 80℃之前？

A：可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。

注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现双峰）。

解决方案：

进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：新配制无误的反应体系，重新实验。

Q：为什么是单峰，但峰不尖锐？

A：可能原因：

存在大小相近的非特异性扩增

解决方案：

a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；

b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

[1] Zhang P, Lu S, Liu Z, et al. Transcriptomic and Metabolomic Profiling Reveals the Effect of LED Light Quality on Fruit Ripening and Anthocyanin Accumulation in Cabernet Sauvignon Grape. Front Nutr. 2021;8:790697. Published 2021 Dec 14. doi:10.3389/fnut.2021.790697(IF:6.576)
[2] Xu B, Zhang C, Jiang A, et al. Histone methyltransferase Dot1L recruits O-GlcNAc transferase to target chromatin sites to regulate histone O-GlcNAcylation. J Biol Chem. 2022;298(7):102115. doi:10.1016/j.jbc.2022.102115(IF:5.157)