CUT&Tag技术中，利用一抗特异性靶向目标蛋白质，之后利用二抗识别一抗来放大信号。随后，含有pA/G-Tn5的转座酶来识别二抗，最后转座酶在结合位点处切割DNA，留下Tn5的核心序列粘贴在切割的DNA处。最后纯化DNA后，利用含有Tn5核心序列的接头进行PCR扩增最终获得我们需要的结合DNA的文库。

 

        那么，一抗、二抗和protein A/G之间的巧妙安排又是何原理呢？

 

       人工制备的一抗，主要是依赖特异性抗原免疫动物而获得，所以目的蛋白对应抗体能够识别目的蛋白。而二抗制备，是利用抗体免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫蛋白。二抗针对某一特定物种的所有抗体（如IgG、IgM或IgA等）均具有反应性。意思就是，如果使用来源于兔源的一抗，那么选择抗兔的二抗即可识别该一抗；使用来源于鼠源的一抗，那么使用抗鼠的二抗即可识别该一抗。

 

       CUT&Tag实验中，推荐使用抗IgG H&L的二抗，它是最常用也是性价比最高的二抗形式。这类抗体和IgG分子的重链和轻链都可以反应，也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD，IgE）和亚家族反应，因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链（但是在使用单克隆抗体时，需要选择与一抗的类别或亚型相匹配的二抗）。同时，还需要要求二抗不带耦联标记（即二抗不能偶联任何标记，HRP、FITC等都不行）。

 

       在细菌表面可分泌表达特殊功能蛋白与免疫球蛋白特异结合，主要分为Protein A金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal proteinA, SPA）、Protein G链球菌G群的细胞表面蛋白 G（Streptococcal protein G, SPG）和Protein L大消化链球菌蛋白L（Peptostreptococcus protein L, PPL），三种均为典型的免疫球蛋白结合蛋白。重组蛋白Protein A由大肠杆菌表达体系获得，由5个IgG 结合结构域E-D-A-B-C串联排列组成，对IgG的Fc片段具有很强的特异性亲和力。重组蛋白Protein G从大肠杆菌表达体系中获得，含有3个IgG 结合区。为确保 IgG 的最大特异性结合，重组蛋白Protein G 中细胞壁结合区、细胞膜结合区和白蛋白结合区已被去除，减少了交叉反应和非特异性结合。重组蛋白Protein A/G在大肠杆菌中产生，由7个IgG 结合结构域EDABC-C1C3组成，对应于5个Protein A的IgG结合区和2个Protein G的IgG结构域。重组蛋白Protein A/G 的结合能力比单独的蛋白A或蛋白G更广。因此，现在CUT&Tag实验中，普遍使用Protein A/G-Tn5来进行靶向切割实验。
 

图1.Protein A、G亲和性

         
       Protein A/G可以与一抗的FC区域结合，也可以与二抗的FC区域结合。CUT&Tag实验中，主要是希望Protein A/G结合二抗达到信号放大。翌圣CUT&Tag试剂盒，将二抗提前与pA/G-Tn5进行孵育，减少了pA/G-Tn5与抗体未识别偶联而产生的非特异切割。同时，CUT&Tag实验时长因此步骤的改变而缩短至6 h。
        这样巧妙的靶向原理get到了么？ 

 

翌圣CUT&Tag试剂盒优势

 

1.翌圣CUT&Tag试剂盒优化了实验体系，使用protein A/G增加抗体特异识别之外，将二抗与protein A/G提前孵育，减少了非特异切割，同时实验时长缩短至6 h；

2.添加spike in，让你的实验结果更真实，更准确。

 

 

图2.Spike in校正后，更能反映数据的真实性

图6.Spike in校正后，基因富集更明显

 

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