植物叶片样本DNA建库全流程指南
植物叶片样本DNA建库全流程指南
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2026-10-09
植物基因组学是现代植物育种、基因功能研究与作物改良的核心基础，随着高通量测序（NGS）技术普及，全基因组测序、简化基因组测序等技术已广泛应用于水稻、玉米、蔬菜等农作物的基因组研究。植物叶片是最常用的 DNA 取材来源，具有取材便捷、对植株损伤小、DNA 含量高、易保存运输等优势。但植物叶片细胞壁坚硬，且富含多酚、多糖、色素等次生代谢物，若去除不彻底会严重抑制酶切、建库等下游反应，因此需标准化流程保障建库质量，本文系统梳理植物叶片 DNA 建库全流程。
叶片预处理与破壁
植物细胞壁由纤维素、果胶构成，需通过液氮冷冻研磨破壁：-196℃低温使组织脆化，配合物理研磨彻底破碎细胞，全程低温可避免核酸酶活化导致 DNA 降解，是植物样本预处理的核心步骤。
玉米叶片液氮研钵研磨图
植物 DNA 提取
翌圣生物18529 磁珠法通用植物 DNA 提取试剂盒，依托磁珠特异性吸附核酸原理，通过裂解、絮凝、洗涤去除蛋白、多糖、多酚等杂质，全程无酚氯仿，安全低毒。1 小时内可完成提取，适配根、茎、叶、种子等各类植物组织，提取的 DNA 纯度高、批间重复性好，可直接用于下游建库实验。
DNA 建库原理
建库是将基因组 DNA 转化为测序文库的过程，核心步骤为片段打断→末端修复→加 A 尾/磷酸化→接头连接→文库扩增；先将基因组DNA随机打断成一定长度片段，再修复片段末端为平末端，3' 端加 A 碱基，5’羟基磷酸化，提高接头连接效率，连接含标签的测序接头，再通过 PCR 富集文库，最终形成适配二代测序平台的测序文库。
样本采集与预处理
选取健康无病虫害的新鲜叶片，切取 0.1-0.5g 组织，去除主叶脉后剪成 1-2cm² 小块；用无菌水或 75% 乙醇快速清洗表面杂质，晾干水分；立即用液氮速冻，在预冷研钵中充分研磨至细粉状，研磨过程持续补充液氮，避免组织解冻。
植物 DNA 磁珠法提取（翌圣 18529）
研磨粉末中加入 600μL 裂解液 + 5μL RNase A，涡旋 1min，静置 5min
加入 100μL 絮凝剂，震荡 15s，冰浴 5min，离心 5min，转移 500μL 上清
加入 450μL 异丙醇 + 20μL 磁珠，涡旋 5min，磁力架静置 2min 后弃液
洗涤液 A、洗涤液 B 各洗涤 2 次，每次涡旋 1min、磁吸 1min 后弃液
室温开盖晾干 5-10min 至无残液，加入 50-100μL 洗脱液，65℃震荡孵育 10min，磁吸收集 DNA 洗脱液
核酸质检
纯度：NanoDrop 检测，A260/A280=1.80-2.00，A260/A230＞2.00，排除蛋白、盐离子、多糖污染
浓度：Qubit 荧光定量，浓度控制在 20-200ng/μL，保证建库起始量充足
完整性：1% 琼脂糖电泳呈现清晰高分子量条带，无降解拖尾，合格 DNA 方可进入下游环节
DNA建库
前期准备：试剂盒组分室温解冻混匀，磁珠室温平衡 30min，现配 80% 乙醇，按测序平台与 DNA 上样量稀释接头
三合一核心反应：冰上配制反应体系，PCR 仪完成DNA 片段化 + 末端修复 + dA 尾添加一步反应
接头连接：向三合一产物中加入接头、连接增强剂与快速连接酶，混匀后进行连接反应
连接产物纯化：加磁珠结合 DNA，磁力架吸附后乙醇漂洗，磁珠干燥后用超纯水洗脱。
（可选）片段分选：按目标插入片段比例，用磁珠做双轮长度分选，获得目标片段
文库扩增：配制 PCR 扩增体系，按程序对连接产物进行扩增富集
扩增产物纯化：用 1.0× 磁珠纯化扩增产物，乙醇漂洗、干燥后洗脱得到终文库
文库质检：qPCR 定量有效文库浓度，毛细管电泳检测片段分布
酶切法建库流程示意图
文库质检与上机
Qubit 定量文库浓度＞2nM，Bioanalyzer 检测主峰符合目标片段大小，无引物二聚体污染；将文库稀释至 2-4nM，按 Illumina 平台要求上机测序.
样本优选晴天上午采集，此时 DNA 含量高，采集后立即速冻，研磨务必充分
多酚、多糖类植物样本，建议用专用植物试剂盒提取，或增加磁珠纯化步骤
全程低温操作，使用无核酸酶耗材，避免 DNA 降解
建库起始 DNA 量控制在 100-500ng，保证文库复杂度与连接效率
每批次实验设置阴性、阳性对照，监控污染与体系稳定性
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类别 |
名称 |
用途 |
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研磨器材 |
液氮、研钵/杵或球磨仪 |
植物叶片破壁 |
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温控设备 |
水浴锅（65℃）、金属浴、PCR仪 |
孵育和扩增 |
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离心设备 |
高速冷冻离心机（可制冷至4℃） |
核酸分离 |
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纯化设备 |
磁力架（适配1.5 mL离心管和96孔板） |
磁珠纯化操作 |
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片段化设备 |
超声波打断仪（Covaris M220或相当型号） |
DNA打断至目标片段 |
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质检设备 |
NanoDrop/Qubit、Bioanalyzer/TapeStation |
DNA纯度、浓度和完整性检测 |
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其他耗材 |
1.5 mL离心管、移液器、涡旋振荡器等 |
常规实验操作 |
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分类 |
产品货号 |
产品名称 |
规格 |
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DNA提取 |
MolPure® Mag Plant DNA Kit磁珠法通用植物DNA提取试剂盒 |
20T/50T/200T |
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DNA提取 |
MolPure® Mag16/48 Plant DNA Kit（Prepackaged）磁珠法16/48孔通用植物DNA提取试剂盒（预封装） |
16 T/48T |
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Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4 |
8T/24T/96T/96T（自动化） |
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机械法建库 |
Hieff NGS® DNA Library Prep Kit 2.0 机械法DNA建库试剂盒 |
8T/24T/96T/96T（自动化） |
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Illumina接头 |
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set1 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set2 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set3 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set4 |
96× 1 T/96× 2 T |
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MGI接头 |
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set1 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set2 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set3 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set4 |
96× 1 T/96× 2 T |
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Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
1mL/2.5mL/5mL/60mL/450mL |
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文库定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 |
100T/500T |
