1）引物设计错误。

1）设计原则：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。

2）判断方法：可用翌圣无缝克隆引物设计软件核对

2）载体与目的片段使用比例失调。

1）载体和目的片段浓度测定方法：常用吸光度法或琼脂糖电泳法。

2）载体与目的片段添加比例：

①单片段建议：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，载体使用量为0.03 pmol；目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。

②多片段建议：最适DNA使用量为每片段（含线性化载体）0.03 pmol。

3）载体与目的片段不纯。

1）推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。

2）纯化产物建议溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3）若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积1/5。

4）操作问题或试剂盒失效。

建议做试剂盒附带的阳性对照实验。判断方法：

1）若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。

2）若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人或换试剂盒进行阳性对照实验，进一步确定问题。

1）感受态细胞效率低，＜10⁷ cfu/μg。

建议用转化效率大于10⁷ cfu/μg的感受态细胞。

判断方法：可转化0.1ng质粒（如PUC19），观察克隆数，若生长大于1000个菌斑，则转化效率大于10⁷ cfu/μg。

2）抗生素种类错误。

建议将未线性化载体转化涂板。

判断方法：若未长克隆，则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。

1）载体线性化不完全。

建议将已制备的线性化的载体转化涂板。  

判断方法：如果长克隆较多，则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。

2）体系中混入了相同抗性的环状质粒。

1）产生原因：

①以反向PCR方式进行载体线性化，残留环状质粒模板导致。

②目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒，残留环状 质粒模板导致。

2）判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用DpnI 消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。

1）PCR产物混有非特异扩增产物。

1）可能情况：PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。

2）解决方案：

①优化PCR体系，提高特异性；

②胶回收PCR产物；

③鉴定更多的克隆。

2）片段缺失。

1）可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。

2）解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI， Vector NTI等）。