荧光定量PCR案例|腺相关病毒AAV滴度测定
样本&试剂&仪器平台
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样本来源 |
病毒由293T细胞包装得到 |
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试剂信息 |
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仪器信息 |
Bio-Rad CFX96 |
扩增片段CG含量&长度
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GC含量 |
56%~61% |
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目标扩增长度 |
192bp~283bp |
反应体系
以三质粒系统（包装质粒、辅助质粒、主质粒）共转染的方式转染293T细胞，转染后72h收取细胞及上清，将胞内及上清液中的病毒颗粒纯化出来，纯化后，使用裂解液裂解病毒颗粒，得到暴露的病毒基因组，裂解后病毒基因组稀释了一百倍。
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组分 |
体积 （μL） |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
10 |
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Forward Primer (10 μM) |
0.4 |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.4 |
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模板DNA/cDNA |
1 |
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无菌超纯水 |
Up to 20 |
反应程序
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
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变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火 |
60℃ |
20 sec |
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延伸 |
72℃ |
20 sec |
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熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 |
1 |
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扩增曲线&熔解曲线
扩增曲线呈现S型曲线，熔解曲线峰型单一，无非特异扩增。
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