烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，辅酶Ⅰ）是细胞中常见的重要辅因子，通过电子交换参与各种代谢反应。NADH（还原性辅酶I）是NAD的还原态。在氧化还原反应中，NADH作为氢和电子的供体，NAD作为氢和电子的受体，参与多种生理过程。NAD/NADH比率可以反应细胞中氧化还原状态。

该试剂盒适用于测定NAD和NADH，背景低，灵敏度高。NADH可以将探针还原为高荧光产物，其信号可以通过荧光酶标仪在Ex/Em = 540/590 nm或在比色测定(OD =576 nm)中定量。

 

产品组分

组分编号	组分名称	组分规格	储存条件
50130-A	NAD/NADH Recycling Enzyme Mix	2 vials	-20℃
50130-B	NADH Sensor Buffer	20 mL×1	-20℃
50130-C	NADH Standard	1 vial (142 µg)	-20℃
50130-D	NADH Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50130-E	NAD Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50130-F	NAD/NADH Control Solution	10 mL×1	-20℃
50130-G	NAD/NADH Lysis Buffer	10 mL×1	-20℃

 

运输和保存方法

冰袋运输。避光保存于-20℃，有效期1年。

 

注意事项

1 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前请先短暂离心，以保证产品全在管底。

4 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。

5 本产品仅用于科研用途。

 

实验过程

1 试剂准备

① NADH标准品母液(1 mM)：将200 μL PBS (pH 7.4)加入NADH Standard（C组分）中制备1 mM NADH标准品母液，用时置于冰上，未用完的分装-20°C保存，避免反复冻融。

② NADH梯度标准液(0-10 μM)：将970 μL PBS (pH 7.4)加入到30 μL NADH标准母液(1 mM)中制备30 μM NADH标准液，然后取200 μL的30 μM NADH标准液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀释成NADH梯度标准液(10 μM, 3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.0411 μM)。

【注】：稀释后的NADH标准液不稳定，应该配置后4 h内使用。

③ NAD/NADH反应液：向每瓶NAD/NADH Recycling Enzyme Mix（组分A）中加入10 mL NADH Sensor Buffer（B组分），混匀。

【注】：相当于96孔板的125次测试的检测用量。NAD/NADH反应液不稳定，注意避光并尽快使用，未用完的分装-20°C保存。

④ NAD/NADH Lysis Buffer（组分G）：用前恢复至室温。

2 样本制备

2.1 细胞样本：收集0.5-1×10⁷个细胞，预冷PBS润洗后，加入100 μL NAD/NADH Lysis Buffer（组分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室温离心5 min，取上清检测。

2.2 组织样本：取20 mg组织样本，预冷PBS润洗后，加入400 μL NAD/NADH Lysis Buffer（组分G），室温匀浆，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

2.3 细菌样本：4°C 10,000 g离心15 min收集细菌，每10⁷个细菌加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（组分G），室温孵育15 min，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

2.4 植物样本：取200 mg叶片，加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（组分G），室温匀浆，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

【注】：建议使用新鲜样本，如果无法及时进行检测，样本建议存于-80 °C，检测时冰上解冻，但是检测的荧光值可能会降低。不要使用RIPA裂解液，因为RIPA裂解液会干扰检测。如果样本中NADH含量高，注意稀释样本。

3 检测过程

3.1 如下图，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADH标准液、待测样本或空白对照(PBS)。

Table 1. Layout of NADH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL	BL	TS (Total)	TS (Total)	TS (NADH)	TS (NADH)	TS (NAD)	TS (NAD)
NS1	NS1	…	…			…	…
NS2	NS2	…	…			…	…
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

NS= NADH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated with NAD/NADH Control Solution , TS (NADH) = test sample treated with NADH Extraction Solution, then neutralized by NAD Extraction, TS (NAD) = test sample treated with NAD Extraction Solution, then neutralized by NADH Extraction Solution

3.3 对于NAD的提取TS (NAD)：向待测样本中加入25 μL NAD Extraction Solution（组分E），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NADH Extraction Solution（组分D）中和。3.2 对于NADH的提取TS (NADH)：向待测样本中加入25 μL NADH Extraction Solution（组分D），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NAD Extraction Solution（组分E）中和。

3.4 对于总NAD和NADH检测TS (Total)：向待测样本中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（组分F），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（组分F）。

3.5 对于NADH标准液NS1-7：向NADH标准液中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（组分F），室温孵育10-15 min，