烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，辅酶Ⅰ）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，氧化型辅酶Ⅱ）是细胞中常见的重要辅因子，通过电子交换参与各种代谢反应。NAD与一个磷酸分子以酯键结合形成NADP，NADP作为氧化剂参与光合作用。还原性辅酶II (NADPH)是NADP接受电子后的产物。NADPH作为供氢体可参与体内多种代谢反应，如：脂肪酸和核酸的合成。

该试剂盒适用于测定NADP和NADPH，背景低，灵敏度高。NADPH可以将探针还原为高荧光产物，其信号可以通过荧光酶标仪在Ex/Em = 540/590 nm或在比色测定(OD =576 nm)中定量。

 

产品组分

组分编号	组分名称	组分规格	储存条件
50140-A	NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix	1 vial×2	-20℃
50140-B	NADPH Sensor Buffer	20 mL×1	-20℃
50140-C	NADPH Standard	1 vial (167 µg)	-20℃
50140-D	NADPH Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50140-E	NADP Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50140-F	NADP/NADPH Control Solution	10 mL×1	-20℃
50140-G	NADP/NADPH Lysis Buffer	10 mL×1	-20℃

 

运输和保存方法

冰袋运输。避光保存于-20℃，有效期1年。

 

注意事项

1 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前请先短暂离心，以保证产品全在管底。

4 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。

5 本产品仅用于科研用途。

 

实验过程

1 试剂准备

① NADPH标准品母液(1 mM)：将200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH Standard（C组分）中制备1 mM NADPH标准品母液，用时置于冰上，未用完的分装-20°C保存，避免反复冻融。

② NADPH梯度标准液(0-10 μM)：将990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH标准母液(1 mM)中制备10 μM NADPH标准液，然后取200 μL的10 μM NADPH标准液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀释成NADPH梯度标准液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。

【注】：稀释后的NADPH标准液不稳定，应该配置后4 h内使用。

③ NADP/NADPH反应液：向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix（组分A）中加入10 mL NADPH Sensor Buffer（B组分），混匀。

【注】：相当于125次测试的检测用量，请根据实际情况进行调整。NADP/NADPH反应液在室温下不稳定，注意避光尽快使用。

④ NADP/NADPH Lysis Buffer（组分G）：用前恢复至室温。

2 样本制备

2.1 细胞样本：收集0.5-1×10⁷个细胞，预冷PBS润洗后，加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（组分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室温离心5 min，取上清检测。

2.2 组织样本：取20 mg组织样本，预冷PBS润洗后，加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（组分G），室温匀浆，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

2.3 细菌样本：4°C 10,000 g离心15 min收集细菌，每10⁷个细菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（组分G），室温孵育15 min，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

2.4 植物样本：取200 mg叶片，加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（组分G），室温匀浆，2500 rpm室温离心5 -10 min，取上清检测。

【注】：建议使用新鲜样本，如果无法及时进行检测，样本建议存于-80 °C，检测时冰上解冻，但是检测的荧光值可能会降低。不要使用RIPA裂解液，因为RIPA裂解液会干扰检测。如果样本中NADPH含量高，注意稀释样本。

3 检测过程

3.1 如下图，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH标准液、待测样本或空白对照(PBS)。

Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL	BL	TS (Total)	TS (Total)	TS (NADPH)	TS (NADPH)	TS (NADP)	TS (NADP)
NS1	NS1	…	…			…	…
NS2	NS2	…	…			…	…
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution

3.2 对于NADPH提取：向待测样本中加入25 μL NADPH Extraction Solution（组分D），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NADP Extraction Solution（组分E）中和。

3.3 对于NADP提取：向待测样本中加入25 μL NADP Extraction Solution（组分E），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NADPH Extraction Solution（组分D）中和。

3.4 对于总NADP和NADPH：向待测样本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（组分F），室温孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（组分F）。