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新品上市│E.coli poly (A) Polymeras

真核生物成熟mRNA的主体序列是编码区（ORF），其上游和下游都有非编码区（UTR），还包括5’帽子和3’尾部结构。3’端的多聚腺苷酸尾巴-Ploy (A)尾，具有维持mRNA的稳定性，调节mRNA翻译效率，维持mRNA运输的作用。
图1.mRNA结构图

 

体外mRNA的加尾方法主要有2种，一是酶法合成，mRNA转录完成后由poly (A)聚合酶加尾；二是共转录，由已经存在于模板质粒DNA或者PCR产物上的poly (A)序列直接转录形成。今天重点介绍基于poly (A)聚合酶的加尾方法。

 

目前，基于Ploy (A)聚合酶的RNA加尾已应用于微生物单细胞测序、mRNA体外合成、miRNA表达分析等场景。

 

微生物单细胞测序

单细胞测序（scRNA-seq）是研究细胞间差异的一种重要技术，目前真核生物的单细胞RNA测序技术已经得到了广泛的应用。在微生物单细胞测序技术中，因微生物mRNA含量较少，没有poly A使其分离困难，细菌尺寸小等问题限制了其应用。

 

为了满足微生物scRNA-seq的需求，已经有科研人员开发了针对微生物的单细胞转录组测序方法，microSPLiT (Microbial Split-Pool Ligation Transcriptomics) 便是其中一种，该方法不需要分离和分选细胞，通过组合条形码对RNA的细胞来源进行标记，可以在一次实验中对数万个细胞进行分析。

 

microSPLiT实验流程为：甲醛固定菌体，吐温和溶菌酶组合处理透化菌体并去除细胞壁，poly (A)聚合酶处理，使mRNA在细胞内连接上poly (A)尾。转录本通过3轮组合barcode被唯一标记，随后进行细胞裂解、文库制备及上机测序[1]。该技术的开发给微生物单细胞转录研究带了极大的助力。
图2. MicroSPLiT实验流程[1]
 

mRNA体外转录

mRNA在转录过程中或转录后需要加帽加尾，以提高mRNA的翻译效率，维持mRNA的稳定性。通过IVT合成mRNA时，加尾方式有两种：模板编码加尾和酶促加尾。模板编码加尾通过在质粒DNA模板中添加poly (A)结构模板，在mRNA转录过程中直接添加poly (A)结构，长度可控。酶促加尾使用Poly (A)聚合酶对mRNA进行修饰加尾，但制备出的Poly (A)尾长度不定，会影响翻译效率。

表1.加尾方式比较

 

miRNA表达分析

miRNA主要与靶基因mRNA的3’端非编码区域特异性结合，调控转录后靶基因mRNA的翻译过程，从而阻断mRNA翻译和促进mRNA降解导致蛋白质表达降低。目前miRNA反转录主要有加尾法和茎环法。茎环法一次反转录仅能检测一个miRNA或内参，操作繁琐，易产生误差。加尾法一次反转录即可检测多种miRNA及内参，操作便捷，准确性高。因此加尾法也是miRNA反转录和荧光定量PCR检测中的主要方法，其中Poly (A)聚合酶在加尾法中起着重要的作用。
图3. miRNA检测方法

 

加尾法利用Poly (A)聚合酶为成熟的miRNA加上Poly (A)尾，然后使用5'端带有通用引物序列的Oligo-dT作为反转录引物，获得人为加长的miRNA cDNA第一链，最后利用与通用引物序列反向互补的反向引物进行染料法的荧光定量PCR检测。加尾法可对miRNA进行无差别加尾，一次反转录即可完成对所有qPCR模板的制备，因此适用于对样本中多个miRNA同时检测。

 

翌圣E.coli poly(A) Polymerase（Cat#14801）由大肠杆菌重组表达，无核酸酶及RNase酶残留，加尾效率高，适用于原核生物单细胞测序、mRNA体外合成、miRNA表达分析等多个应用场景。
 

数据展示

1.无核酸外切酶残留。

图4. 核酸外切酶残留检测。将15 U poly(A) Polymerase和0.5 μg λDNA-HindⅢ digest于37℃孵育2小时，

结果显示翌圣E.coli poly(A) Polymerase（Cat#14801）核酸外切酶残留水平与进口品牌一致。

 

2.应用于miRNA检测，灵敏度更高。

 

图5. 以10ng、1000ng人源总miRNA为模板，使用翌圣E.coli poly(A) Polymerase（Cat#14801）进行加尾法反转录，获得的cDNA进行qPCR检测。

结果显示翌圣E.coli poly(A) Polymerase应用于miRNA反转录，灵敏度优于品牌A。

 

相关产品

产品定位

产品名称

产品货号

加尾法酶

E.coli poly(A) Polymerase (5 U/μL）

14801ES

加尾反应原料

ATP Solution GMP-grade (100 mM)

10129ES

加尾法反转定量

Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(加 A 法)

11148ES

Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(加A法)

11171ES
 

参考文献

[1] Chaudhary, Namit et al. “mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation.” Nature reviews. Drug discovery vol. 20,11 (2021): 817-838. 
 

400-6111-883