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新品上市│单细胞测序关键酶——phi29 DNA聚合酶

单细胞测序是研究细胞间差异的一种重要技术，但由于单个细胞的基因组DNA含量较低（pg级别），无法满足各大测序平台上机要求，需要通过全基因组扩增技术（WGA）来解决该问题。其中多重置换扩增（MDA）是目前应用最广泛的单细胞全基因组扩增技术。phi29 DNA聚合酶作为MDA的核心酶原料发挥了不可替代的作用，接下来小翌为大家详细介绍phi29 DNA聚合酶。
 
图1.单细胞测序流程图[1]
 
 

phi29 DNA聚合酶

phi29 DNA聚合酶来源于Bacillus subtilis噬菌体phi29，具有很强的链置换活性及持续合成能力，可实现对DNA复杂结构解链与复制，在体外进行不依赖于热循环的等温DNA聚合反应，最终产生大量高分子量的DNA。此外phi29 DNA 聚合酶还具有3'到5'外切酶校正能力，其保真度高于目前绝大多数DNA聚合酶。

 

phi29 DNA聚合酶基于以上特性拥有十分广阔的应用场景，如多重置换扩增（MDA）、滚环扩增（RCA）、全基因组扩增（WGA）和SNP检测等。下面小翌给大家介绍应用较为广泛的MDA和RCA技术。

 

多重置换扩增（MDA）

MDA的基本原理是使用随机的六聚体引物和phi29 DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增。反应时，引物六聚体先随机结合到DNA模板上，随后phi29 DNA聚合酶在DNA的多个位点同时开始复制。复制合成的DNA取代模板的互补链，被置换的互补链可以成为新的模板进行扩增。MDA可以从少量样本中获取大量高质量DNA，是目前应用最广泛的单细胞全基因组扩增方式。
 
图2.MDA原理图[1]
 

滚环扩增（RCA）

RCA是模拟自然界微生物环状DNA滚环复制过程，建立起来的一种核酸检测方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在phi29 DNA聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链，最终产生重复的长单链DNA产物。在RCA基础上通过引入与延伸产物退火杂交的另一条或多条引物可形成超分支RCA，实现超指数式扩增。RCA技术具有灵敏度高，特异性好，易操作等特点，因此可应用于SNP检测、质粒体外酶促生产、DNA测序模板制备等场景。
图3.RCA原理图[2]。A: 以单引物扩增产生长链DNA；B: 以随机引物扩增产生长链串联DNA

 

翌圣的phi29 DNA聚合酶由大肠杆菌菌株重组表达而来，具有高保真度及卓越的链置换和持续合成能力，可合成长达70 kb的DNA片段。非常适用于单细胞全基因扩增、质粒体外酶促生产、测序模板制备等场景。

 

性能展示

1. 高灵敏度：可对pg级别的DNA模板进行有效扩增。

图4. 翌圣及品牌A phi29 DNA聚合酶不同DNA模板投入量扩增结果。C1:无模板对照，C2：无酶对照。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404）灵敏度及扩增产量优于竞品。

 

2. 高扩增产量：100ng模板投入，产量可达2 μg/μL。
图5. 翌圣phi29 DNA聚合酶扩增产量。模板：293细胞gDNA，投入100ng；反应时间：16h。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404）在100ng模板投入量下，扩增产量可达到2 μg/μL。
 
3. 无核酸外切酶、切口酶残留。
图6. phi29 DNA聚合酶核酸外切酶及切口酶检测电泳图。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404）无核酸外切酶及切口酶残留。
 

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产品定位

产品名称

产品货号

常规款，含反应buffer

phi29 DNA Polymerase (10 U/μL)

14404ES

高浓度，单酶，不含反应buffer

phi29 DNA Polymerase (100 U/μL)

14409ES

高浓度单酶反应buffer

10×phi29 Reaction Buffer

15442ES

扩增原料

dNTP Mix(25 mM each)

10125ES

 

 

参考文献

[1] Rato S, Golumbeanu M, Telenti A, Ciuffi A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 2017;239:55-68.

[2] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

[3] Johne R, Müller H, Rector A, van Ranst M, Stevens H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends Microbiol. 2009;17(5):205-211.

400-6111-883