cfDNA简介、研究方法和应用

2026-10-19

YEASEN

导读

细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指游离于人体细胞外，存在于血液（血浆、血清）、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹腔积液等各类体液中的双链DNA片段。cfDNA的产生主要源于两种途径：一是细胞死亡等过程中核酸发生裂解，二是DNA修复机制的运作，可分为循环肿瘤DNA（ctDNA）、游离胎儿DNA（cffDNA）、供体来源游离DNA（dd-cfDNA）及游离线粒体DNA（ccf mtDNA）等亚型，分别对应不同的临床应用场景。自1948年，法国科学家Mandel和Metais首次在人体血浆中发现了游离于细胞外的DNA片段，此后数十年，随着检测技术的迭代升级，cfDNA的生物学特征及临床价值被逐步挖掘。cfDNA作为细胞凋亡、坏死或主动分泌过程中释放到体液中的核酸片段，携带了来源细胞的基因组信息，其分子特征的改变可直接反映机体的生理变化和疾病进展，为疾病的无创诊断、疗效监测及预后评估提供了全新的分子标志物。相较于传统组织活检，cfDNA检测具有无创、便捷、可重复取样等优势，已成为精准医疗领域的研究热点，在肿瘤、产前诊断、器官移植等多个临床领域实现了快速转化与应用。

cfDNA长度通常在150–200 bp左右，与核小体结构密切相关。在肿瘤患者中，cfDNA中包含一部分来源于肿瘤细胞的DNA，称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），其比例可低至0.01%，是液体活检的核心检测对象。cfDNA的半衰期较短（约1–2小时），能够实时反映体内细胞的动态变化，这一特性使其成为疾病监测的理想生物标志物。近年来，随着对cfDNA生物学特征（如片段化模式、甲基化特征、末端基序等）认识的深入，以及新一代测序（NGS）技术的成熟，cfDNA分析已能够高灵敏度地检测肿瘤特异性突变、拷贝数变异（CNVs）和表观遗传学改变。

cfDNA检测主要包括样本采集与预处理、cfDNA的提取、检测分析三个核心环节，每个环节的技术水平直接影响检测结果的准确性和可靠性。

cfDNA样本采集及提取

cfDNA的检测可以根据目的进行样本选择，常用于cfDNA检测的样本有血浆、血清、唾液、粪便和尿液等，这些样本易于提取且cfDNA含量相对较高。尽管血浆和血清都可作为液体样本，但由于血浆样本能够避免所含血细胞裂解引起的DNA污染，所以在临床检验和实验中被优先使用。此外，在样本选择上，脑脊液通常作为中枢神经系统疾病的样本。怀孕母体的羊水可作为胎儿cfDNA样本，在粪便中可检测胃肠道疾病所产生的cfDNA，关节液可作为类风湿关节炎患者cfDNA的检测样本。因此，选择合适的样本对于cfDNA的临床检测具有重大意义。cfDNA提取的前处理环节也至关重要，样本采集时需选择合适的抗凝剂（如EDTA），避免使用肝素（会抑制后续PCR反应）；样本采集后需及时离心分离血浆，避免细胞裂解释放基因组DNA污染cfDNA，同时样本需低温保存和运输，减少cfDNA的降解。

cfDNA的提取核心目标是高效、纯净地从体液样本中分离出cfDNA，最大限度减少细胞基因组DNA污染、蛋白质及核酸酶等杂质的干扰，同时保留cfDNA的完整性和片段特征。目前，cfDNA提取技术主要基于核酸与杂质的理化性质差异设计，常用方法包括酚-氯仿法、硅胶柱吸附法、磁珠法，后两者可结合自动化提取设备实现自动化提取。

1、硅胶柱吸附法：

基于硅胶在高盐环境下对核酸的特异性吸附作用，通过离心使cfDNA吸附到硅胶柱上，再用低盐缓冲液洗脱，实现cfDNA的纯化。该方法操作相对简便，纯度较高，能有效去除部分杂质和PCR抑制剂，但对短片段cfDNA的回收率较低，且离心过程中可能导致cfDNA片段丢失。

2、磁珠法：

目前临床应用最广泛的提取方法，利用表面修饰有特异性基团（如羧基、硅羟基）的磁珠，在特定缓冲液条件下与cfDNA特异性结合，通过磁力分离实现cfDNA与杂质的分离，再经洗脱获得高纯度cfDNA。该方法具有操作简便、自动化程度高、提取效率高、对短片段cfDNA回收率高、杂质去除效果好等优势，可有效避免cfDNA片段断裂，适用于批量样本处理，是目前cfDNA提取的主流技术；其局限性在于磁珠成本较高，部分磁珠可能存在非特异性吸附，影响提取纯度。

cfDNA的检测

cfDNA检测方法主要分为两大类：一类是针对cfDNA总量及片段特征的检测，另一类是针对cfDNA分子序列及修饰特征的检测。随着分子生物学技术的发展，检测方法的灵敏度和特异性不断提升，已从传统的定量检测发展到精准的基因变异和表观遗传修饰检测。

1、实时荧光定量PCR（qPCR）：

最常用的cfDNA定量方法，基于特异性引物扩增cfDNA片段，通过荧光信号的变化实时监测扩增过程，计算cfDNA的浓度。该方法操作简便、快速、灵敏度较高，可实现cfDNA的准确定量，但只能检测特定片段的含量，无法反映cfDNA的整体总量和片段分布特征，且易受引物特异性影响。

2、数字PCR（ddPCR）：

将样本稀释后分配到大量微反应单元中，每个单元进行独立PCR扩增，通过计数阳性反应单元的数量计算cfDNA的绝对浓度。该方法灵敏度极高，可检测到低丰度cfDNA（如ctDNA），定量准确性优于qPCR，适用于微量cfDNA的定量检测，如肿瘤早期ctDNA的检测、产前cffDNA的定量等，但成本较高，操作相对复杂，通量较低。

3、下一代测序（NGS）技术：

目前cfDNA序列检测的主流技术，包括全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和靶向测序（Targeted Sequencing）。WGS可全面检测cfDNA的所有基因变异和片段特征，但成本较高、数据量巨大、分析复杂；WES主要检测编码区基因变异，成本低于WGS，适用于已知致病基因的筛查；靶向测序针对特定基因或区域进行测序，成本低、通量高、灵敏度高，适用于临床常规检测，如肿瘤驱动基因变异检测、产前染色体异常筛查等。NGS技术可同时检测多种基因变异，是cfDNA精准检测的核心技术，但存在测序误差、数据解读复杂等问题，需要专业的生物信息学分析平台支撑。

图：cfDNA的NGS分析

4、纳米孔测序技术（ONT）：

近年来快速发展的长读长测序技术，通过测量单链cfDNA穿过纳米孔时产生的电流信号，直接识别序列和表观遗传修饰（如甲基化），无需PCR扩增和亚硫酸氢盐转化，可实现cfDNA多组学信息（片段组学、遗传学、表观遗传学）的同步捕获。

5、甲基化检测技术：

cfDNA甲基化是重要的表观遗传特征，与疾病的发生发展密切相关，常用检测方法包括甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸氢盐测序（BSP）、甲基化NGS等。

cfDNA的应用

cfDNA携带来源细胞的基因组和表观遗传信息，其分子特征的改变与疾病的发生、发展、预后密切相关，目前已广泛应用于肿瘤、产前诊断、器官移植、心血管疾病等多个临床领域，成为无创诊断和精准医疗的重要工具。

1、肿瘤：

肿瘤领域是cfDNA应用最成熟、最广泛的领域，其中ctDNA（肿瘤细胞释放的cfDNA）是核心标志物，可用于肿瘤的早期筛查、诊断分型、疗效监测、复发预警及预后评估，实现肿瘤的全病程管理。

2、产前诊断：

游离胎儿DNA（cffDNA）是胎儿细胞释放到母体血液中的cfDNA，占母体外周血cfDNA的3%~10%，其携带胎儿的基因组信息，可用于胎儿染色体异常和单基因遗传病的无创产前筛查（NIPT），具有无创、安全、准确等优势，已成为产前诊断的常规手段。

3、器官移植领域：

供体来源游离DNA（dd-cfDNA）是供体器官细胞释放到受体血液中的cfDNA，其含量变化可反映供体器官的损伤程度和排斥反应情况，为器官移植后的监测提供无创标志物。

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